Модификация методики выделения микроРНК из растений фенол-хлороформной экстракцией с применением полиэтиленгликоля 1500
Аннотация
МикроРНК – класс малых некодирующих РНК, имеющих длину от 18 до 25 нуклеотидов и встречающихся в большинстве эукариотических организмов. Важное значение микроРНК могут играть эпигенетических механизмах регуляции генома, включая метилирование ДНК, модификацию РНК и гистонов. Современные методы обнаружения и количественного определения микроРНК в значительной степени основаны на клонировании, нозерн-блоттинге или удлинении праймера, но каждый из них требует наличия чистого препарата анализируемого типа РНК. Стандартный метод выделения РНК, основанный на фенол-хлороформной экстракции со специфическими соосадителями нуклеиновых кислот, позволяет получать препараты суммарной клеточной РНК с преобладанием высокомолекулярных типов рибонуклеиновых кислот. Это в значительной степени затрудняет проведение идентификации и количественной оценки микроРНК в препаратах образцов. Модификация метода фенол-хлороформной экстракции РНК, основанном на ее преципитации ДНК со специфическим осадителем, таким как хлорид лития, показала, что применение полиэтиленгликоля 1500 с использованием в качестве осадителя 2.5 М LiCl в присутствии 96% этанола обеспечивает высокий выход и качественную экстракцию микроРНК, которую можно использовать для дальнейших аналитических исследований. Проведение ПЦР для оценки качества выделенной микроРНК со специфическими праймерами к miR165a показало наличие одного продукта амплификации размером около 80 п.н., что соответствует теоретическим значениям, рассчитанным на основе разработанного зонда для данной микроРНК. Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в используемой матрице анализируемой микроРНК. Следовательно, применение модифицированной методики выделения РНК с использованием полиэтиленгликоля 1500 (ПЭГ 1500) в качестве элемента разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных нуклеиновых кислот позволило получить препараты микроРНК, которые можно применять для дальнейших аналитических исследований.
Скачивания
Литература
Chuang J.C., Jones Р.A Epigenetics and MicroRNAs. Pediatric Research. 2007; 61: 24-29.
Arif K.M.T., Elliott E.K., Haupt L.M., Griffiths L.R. Regulatory Mechanisms of Epigenetic miRNA Relationships in Human Cancer and Potential as Therapeutic Targets. Cancers (Basel). 2020; 12: 2922.
Yao Q., Chen Y. Zhou X. The roles of microRNAs in epigenetic regulation. Current Opinion in Chemical Biology. 2019; 51: 11-17.
He L., Hannon G.J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 2004; 5: 522-531.
Lagos-Quintana M., Rauhut R., Lendeckel W., Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 2001; 294: 853-858.
Zeng Y., Cullen B.R. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA. 2003; 9: 112-123.
Krichevsky A.M., King K.S., Donahue C.P., Khrapko K., Kosik K.S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 2003; 9: 1274-1281.
Liu C.G., Calin G.A., Meloon B., Gamliel N., Sevignani C., Ferracin M., Dumitru C.D., Shimizu M., Zupo S., Dono M., Alder H., Bullrich F., Negrini M., Croce C.M. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in hu-man and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2004; 101: 9740-9744.
Nicot N., Hausman J-F., Hoffmann L., Evers D. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in po-tato during biotic and abiotic stress. Journal of Experimental Botany. 2005; 56: 2907-2914.
Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 1996; 6: 986-994.
Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J., Guegler K.J. Realtime quantification of microRNAs by stemloop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2005; 33: e179.
Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochem-istry. 1987; 162: 156-159.
Kramer M.F. Stem-Loop RT-qPCR for miRNAs. Current Protocols in Molecu-lar Biology. 2011; CHAPTER: Unit15.10: 1-15.
Lakin G.F. Biometrics. M.: Higher. school, 1990. 351p.
Yoshinaga N., Naito M., Tachihara Y., Boonstra E., Osada K., Cabral H., Uchida S. PEGylation of mRNA by Hy-bridization of Complementary PEG-RNA Oligonucleotides Stabilizes mRNA without Using Cationic Materials. Pharmaceutics. 2021; 13: 800.
An Z., Wang Q., Hu Y., Zhao Y., Li Y., Cheng H., Huang H. Co-extraction of high-quality RNA and DNA from rubber tree (Hevea brasiliensis). African Journal of Biotechnology. 2012; 11: 9308-9314.
Selemenev V.F., Rudakova L.V., Rudakov O.B., Belanova N.A., Nazarova A.A. Fosfolipidy na fone prirodnyh matric Voronezh. Voronezh: Publishing House. Center "Scientific book". 2020. 318 p.
Selemenev V.F., Rudakov O.B., Slav-inskaya G.V., Drozdova N.V Pigmenty pishchevyh proizvodstv (melanoidiny). M: Delhi print. 2008. 246 p.
