Очистка транскрипционного фактора YihW из пробиотического штамма E. coli Nissle 1917 с использованием аффинной хроматографии на спин-колонках
Аннотация
Транскрипционные факторы бактерий в силу своей токсичности трудно поддаются экспрессии, а в силу склонности к олигомеризации - очистке, и для каждого белка требуется индивидуальный подбор оптимальных условий. В работе был создан вектор для суперпродукции транскрипционного фактора YihW (CsqR) из пробиотического штамма Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) и подобраны оптимальные условия для его синтеза в гомологичной экспрессионной системе: экспрессия в клетках штамма BL21(DE3)-Codon Plus-RIL; индукция 50мкМ IPTG в течение 5 часов при 37°С. Была разработана схема быстрой и эффективной очистки YihW с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA смоле, представленной в виде колонок для центрифугирования, сочетающая в себе условия для очистки белков в нативных и денатурирующих условиях, с последующим ступенчатым диализом. Разработанный нами метод позволяет получить гомогенный белковый препарат 95% чистоты, который является функционально активным. Активность полученного препарата YihW была подтверждена с помощью оценки эффективности его связывания с ДНК-мишенью путем электрофоретического разделения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле.
Скачивания
Литература
Shulami S., Gat O., Sonenshein A. L., Shoham Y. Journal of bacteriology.1999; 181(12): 3695-704. https://doi.org/10.1128/JB.181.12.3695-3704.1999
Baba T., Ara T., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Baba M., Datsenko K.A., Tomita M., Wanner B.L., Mori H. Molecular systems biology. 2006; 2:2006.0008. https://doi.org/10.1038/msb4100050
Cronan J.E. Molecular microbiology. 2021; 115(6): 1080-1085. https://doi.org/10.1111/mmi.14663
Wen Y., Ouyang Z., Devreese B., He W., Shao Y., Lu W., Zheng F. Protein Science. 2017; 26: 2073-2082. https://doi.org/10.1002/pro.3245
Kaznadzey A., Shelyakin P., Belousova E., Eremina A., Shvyreva U., Bykova D., Eme-lianenko V., Korosteleva A., Tutukina M., Gel-fand M.S. Scientific Reports. 2018; № 8(1): 3177. https://doi.org/10.1038/s41598-018-21534-3
Shimada T., Yamamoto K., Nakano M., Watanabe H., Schleheck D., Ishihama A. Microbiology. 2019; 165(1): 78-89. https://doi.org/10.1099/mic.0.000740
Larson T. J., Ye S., Weissenborn D.L., Hoffmann H.J., Schweizer H. The Journal of Biological Chemistry. 1987; 262(33): 15869-15874. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)47669-7
Mortensen L., Dandanell G., Hammer K. The EMBO journal. 1989; 8(1): 325-331. https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1989.tb03380.x
Zeng X., Saxild H.H., Switzer R.L. Journal of bacteriology. 2000; 182(7): 1916-22. https://doi.org/10.1128/JB.182.7.1916-1922.2000
Garces F., Fernandez F.J., Gomez A.M., Perez-Luque R., Campos E., Prohens R., Aguilar J., Baldoma L., Coll M., Badia J., Cristina Vega M. Biochemistry. 2008; 47(44): 11424-11433. https://doi.org/10.1021/bi800748x
Sonnenborn, U., Schulze, J. Microbial Ecology in Health and Disease. 2009; 21(3-4): 122-158. https://doi.org/10.3109/08910600903444267
Sonnenborn U. FEMS Microbiol Lett. 2016; 363(19): fnw212. https://doi.org/10.1093/femsle/fnw212
Rybina A.A., Glushak R.A., Bessonova T.A., Dakhnovets A.I., Rudenko A.Y., Ozhi-ganov R.M., Kaznadzey A.D., Tutukina M.N., Gelfand M.S. Scientific Report. 2024; 14(1): 7852. https://doi.org/10.1038/s41598-024-58492-y
Igarashi K., Ishihama A. Cell. 1991; 65(6): 1015-1022. https://doi.org/10.1016/0092-8674(91)90553-b
Bessonova T.A., Lekontseva N.V., Shvyreva U.S., Nikulin A.D., Tutukina M.N., Ozoline O.N. Protein expression & purifica-tion. 2019; 161: 70-77. https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.05.001
Potapova, A. V., Ozoline, O. N., Tutu-kina, M. N. The development of effective overproduction and purification approaches for ExuR transcription factor of Escherichia coli using affine chromatography. Sorbtsionnye I Khromatograficheskie Protsessy, 2014; 14(3): 537-539. (In Russ.)
Protokol proizvoditelya dlya Ni-NTA Spin Kit (Qiagen). Rezhim dostu-pa: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/protein-purification/tagged-protein-expression-purification-detection/ni-nta-spin-system. (data obrashheniya: 15.05.2025) (In Russ.)
Ozoline O.N, Fujita N., Murakami K., Ishihama A. European Journal of Biochemis-try. 1998; 253(2): 371-81. https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.1998.2530371.x
Laemmli U.K. Nature. 1970; 227(5259): 680-685. https://doi.org/10.1038/227680a0
