Сравнение сорбционных методов выделения тотальной ДНК из мышечной ткани: влияние на выход и целостность митохондриальной ДНК
Аннотация
Нейромышечные заболевания, связанные с генетическими и митохондриальными нарушениями, требуют высококачественного выделения ДНК из мышечной ткани для последующего молекулярно-генетического анализа. В данной работе проведена сравнительная оценка методов экстракции тотальной ДНК из скелетных мышц мыши, включая преципитацию, сорбцию на силикатных мембранах, сыпучих сорбентах и магнитных частицах. Результаты показали, что, несмотря на наибольший выход тотальной ДНК при преципитации, доля митохондриальной ДНК (мтДНК) в этих образцах минимальна из-за неселективного осаждения деградированных фрагментов ядерной ДНК. Напротив, методы сорбции на колонках и магнитных частицах обеспечивают значительно более высокое содержание мтДНК (в 4,5 раза выше) и лучшую сохранность митохондриального генома. При этом сыпучие сорбенты продемонстрировали наибольший уровень повреждений мтДНК, что связано, по всей видимости, с механической фрагментацией и неоптимальной элюцией. Для оценки целостности мтДНК наиболее эффективной оказалась количественная ПЦР в реальном времени с SYBR Green, которая, в отличие от качественных методов, позволяет точно детектировать даже незначительные повреждения. Важно отметить, что SYBR Green не оказывал ингибирующего эффекта на амплификацию фрагментов длиной ~2 т.п.н., что подтверждает применимость этого подхода для анализа мтДНК. Наибольшая уязвимость к повреждениям наблюдалась в D-петле мтДНК — ключевом регуляторном участке, что особенно важно при изучении митохондриальной дисфункции в мышечной ткани. Таким образом, для исследований мтДНК оптимальны методы сорбции на колонках или магнитных частицах в сочетании с количественной ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и достоверность результатов.
Скачивания
Литература
Gao F., Schon K.R., Vandrovcova J., Wilson L., Hanna M.G. Ann Clin Transl Neu-rol. 2024; 12: 1680-1688. https://doi.org/10.1002/acn3.52141
Dubinin M.V., Mikheeva I.B., Stepano-va A.E., Igoshkina A.D., Cherepanova A.A., Semenova A.A., Sharapov V.A., Kireev I.I., Belosludtsev K.N. Biomolecules. 2024; 14: 316. https://doi.org/10.3390/biom14030316
Gureev A.P., Nesterova V.V., Sadovni-kova I.S. DNA Repair (Amst). 2025; 146: 103812. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2025.103812
Helbock H.J., Beckman K.B., Shigenaga M.K., Walter P.B., Woodall A.A., Yeo H.C., Ames B.N. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 288-293. https://doi.org/10.1073/pnas.95.1.288
Preetha Sh. American Journal of Bio-medical Science & Research. 2020; 8: 39-45. https://doi.org/10.34297/AJBSR.2020.08.001234
Patent № 5705628. DNA purification and isolation using magnetic particles. Haw-kins T. 1998. Whitehead Institute for Biomedi-cal Research, Cambridge. Mass.
Gureev A.P., Shaforostova E.A., Starkov A.A., Popov V.N. Toxicology. 2017; 382: 67-74. https://doi.org/10.1016/j.tox.2017.03.010.
Gureev A.P., Nesterova V.V., Sadovni-kova I.S. DNA Repair (Amst). 2025; 146; 103812. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2025.103812
Gonzalez-Hunt C.P., Thacker E.A., Tos-te C.M., Boularand S., Deprets S., Dubois L., Sanders L.H. Sci Rep. 2020; 10: 17293. https://doi.org/10.1038/s41598-020-74195-6
Gureev A.P., Andrianova N.V., Pevzner I.B., Zorova L.D., Chernyshova E.V., Sa-dovnikova I.S., Chistyakov D.V., Popkov V.A., Semenovich D.S., Babenko V.A., Sila-chev D.N., Zorov D.B., Plotnikov E.Y., Popov V.N. FEBS J. 2022; 289: 5697-5713. https://doi.org/10.1111/febs.16451
Meyer J.N. Ecotoxicology. 2010; 19: 804-811. https://doi.org/10.1007/s10646-009-0457-4
Hettiarachchi E., Grassian V.H. Lang-muir. 2024; 40: 27194-27205. https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.4c02501
Karpov S.I., Selemenev V.F. In-frakrasnaya spektroskopiya sorbenkov: uchebnoe posobie / Voronezh : Izdatel`ko-poligraficheskij centr «Nauchnaya kniga», 2024. 376 p. (In Russ.)
Malik A.N., Czajka A. Mitochondrion. 2013; 13(5): 481-492. https://doi.org/10.1016/j.mito.2012.10.011
Mazunin I.O., Volod`ko N.V., Starikovskaya E.B., Sukernik R.I. Mole-kulyarnaya biologiya. 2010; 44(5): 755-772. (In Russ.)
Supruniuk E., Górski J., Chabowski A. Antioxidants (Basel). 2023; 12(2): 501. https://doi.org/10.3390/antiox12020501
Williams G.S.B., Boyman L., Chikando A.C., Khairallah R.J., Lederer W.J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(26): 10479-10486. https://doi.org/10.1073/pnas.1300410110
Caliendo A.M., Schuurman R., Yen-Lieberman B., Spector S.A., Andersen J., Man-jiry R., Crumpacker C., Lurain N.S., Erice A. J Clin Microbiol. 2001; 39(4): 1334-1338. https://doi.org/10.1128/JCM.39.4.1334-1338.2001
Lehle S., Hildebrand D.G., Merz B., Malak P.N., Becker M.S., Schmezer P., Ess-mann F., Schulze-Osthoff K., Rothfuss O. Nu-cleic Acids Research. 2014; 42: e41. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1349.
Edwards J.G. Mitochondrion. 2009; 9: 31-35. https://doi.org/10.1016/j.mito.2008.11.004
