Применение модифицированного SEPHADEXR в качестве аффинного сорбен-та для выделения микроРНК775А

Аннотация

Важным показателем в исследованиях малых некодирующих РНК является их количество, в связи с чем возникает необходимость получения их в чистом виде. Существует несколько методик выделения микроРНК, основанных на различных принципах, в каждом из которых есть недостатки. Стандартные методы выделения РНК из растений, основанные на фенол-хлороформной экстракции со специфическими соосадителями нуклеиновых кислот, таким как хлорид, позволяют получать препараты суммарной клеточной РНК с преобладанием высокомолекулярных типов рибонуклеиновых кислот. Это в значительной степени затрудняет проведение идентификации и количественной оценки микроРНК в препаратах образцов. Изучение микроРНК и применение их в биотехнологии – активно развивающаяся область науки, поэтому разработка метода очистки для конкретной микроРНК позволит использовать данные малые РНК, например, в качестве биомаркеров. Нами был разработан протокол получения аффинного сорбента на основе Sephadex^R G-75, представляющего собой полимерную декстрановую подложку с прикрепленными к ней комплементарными нуклеотидными последовательностями к микроРНК775А. В качестве линкера выступает аденозинтрифосфат, который под воздействием УФ-излучения присоединяется к цепочке декстранов, как предполагается, путем образования эфирной связи. Вследствие прикрепления dАТФ к сефадексу, появилась возможность провести лигазную реакцию с комплементарной последовательностью, представляющую собой лиганд для малой РНК, с флуоресцентно-меченым карбокси-Х родамином (ROX) олигонуклеотидом на 3'-конце. УФ-модификацированный Sephadex^R G-75 с присоединенным лигандом, комплиментарным к микроРНК775А, позволил выделить анализируемую микроРНК из общей мРНК клеток листьев кукурузы. Результаты аффинной хроматографии с применением модифицированного Sephadex^RG-75 подтвердились ПЦР в реальном времени. Разработанный метод аффинной хроматографии для микроРНК775А позволил получить ее гомогенный препарат с эффективность выделения 92%. Оценка количественного содержания других микроРНК (микроРНК165a, микроРНК159b) в образце с суммарной РНК, выделенной из растительного материала, не показала их наличия, что указывает на специфичность полученного модифицированного Sephadex^RG-75 к целевой микроРНК775А.