Использование ионообменной хроматографии для получения гомогенного препарата глутаматдегидрогеназы из проростков пшеницы
Аннотация
Благодаря пятистадийной очистке был получен гомогенный препарат глутаматдегидрогеназы (ГДГ, L-глутамат: НАД(Ф)Н-оксидоредуктаза 1.4.1.3), очищенный в 319.5 раз с удельной активностью 377 Е/мг белка и выходом 3.7%. Обычно очистка энзимов в нашей лаборатории осуществляется по следующей общей схеме: гомогенизация растительного материала (получение экстракта энзима), фракционирование белков-ферментов сульфатом аммония, гель-фильтрация на сефадексе G-25, обеспечивающая обессоливание белков, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Sephacel, десорбция ферментативной активности осуществлялась градиентом концентрации NaCl (0.15-0.3 М). Последнюю стадию очистки осуществляли путем гель-хроматографии на сефадексе G-200. Известно, что ингибирующее действие на глутаматдегидрогеназу оказывают АТФ и метаболические интермедиаты (глутамат и 2-оксоглутарат). Активация ферментативной активности наблюдается при воздействии АМФ, ионов кальция и магния, а также сульфата аммония. Наибольший эффект из перечня всех хроматографических методов (ионообменная, распределительная, гель-фильтрация и др.) имело использование ДЭАЭ-Sephacel. При этом степень очистки ГДГ составляла более чем в 300 раз.
Проведенный ПААГ-электрофорез с последующим специфическим проявлением тетразолиевым методом позволил обнаружить у очищенного белка глутаматдегидрогеназную активность. pH-оптимум полученной ГДГ по реакции восстановительного аминирования составляет 8.5, также как и по реакции окислительного дезаминирования. Были получены кинетические характеристики сродства глутаматдегидрогеназы к субстратам различной природы. Величины константы Михаэлиса для 2-оксоглутарата составляли 2.75, а для глутамата – 14.9, что может говорить о преобладании β-субъединиц в структуре олигомера ГДГ. Анализ этих данных свидетельствует о значительно большем сродстве исследуемого энзима к 2-оксоглутарату.
Скачивания
Литература
Eduardo S., Hervás A.B., Canosa I., Govantes F., InTech, 2012, pp. 289-318. DOI: 10.5772/47767
Pasquo A., Britton K.L., Stillman T.J., Rice D.W. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1996, Vol. 1297, pp. 149-158. DOI: 10.1016/s0167-4838(96)00017-9
Garnier A., Berredjem A., Botton B., Fungal Genetics and Biology, 1997, Vol. 22, pp. 168-176.
DOI: 10.1006/fgbi.1997.1004
Hammer B.A., Johnson E.A., Arch. Mi-crobiol, 1988, Vol. 150, pp. 460-464.
DOI: 10.1007/BF00422287
Lam H.M., Coschigano K.T., Oliveira I.C., Melo-Oliveira R. et al., Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1996, Vol. 47, pp. 569-593. DOI: 10.1146/annurev.arplant.47.1.569
Nagel M., Hartmann T., Naturforsch, 1980, Vol. 35, pp. 406-415. DOI: 10.1515/znc-1980-5-610
Turano F.J., Thakkar S.S., Fang T., Weisemann J.M., Plant Physiol, 1997, Vol. 113, No 4, pp. 1329-41.
DOI: 10.1104/pp.113.4.1329
Turano F., Dashner R., Upadhyaya A., Caldwell C.R., Plant physiology, 1996, Vol. 112, pp. 1357-1 364.
DOI: 10.1104/pp.112.3.1357
Consalvi V., Chiaraluce R., Politi L., Scandurra R., Comp. Biochem. Physiol. B, 1994, Vol. 109, pp. 691-699.
DOI: 10.1016/0305-0491(94)90132-5
Kujo C., Oshima T., Appl. Environ. Microbiol, 1998, Vol. 64, pp. 2152-2157.
DOI: 10.1128/AEM.64.6.2152-2157.1998
Selemenev V.F., Rudakov O.B., Slavinskaya G.V., Drozdova N.V. Pigments for food production (melanoidins), M., DeLi print, 2008, 246 p.
Ramirez H., Maria J. Delgado, Gar-cia-Peregrin E., Pflanzenphysiol, 1977, Vol. 84, pp. 109-119.
DOI: 10.1016/S0044-328X(77)80183-9
Grabovska A., Zdunek-Zastocka E., Kutryn E., Kwinta J., Acta Physiol Plant, 2017, Vol. 39, No 24,
DOI 10.1007/s11738-016-2322-4
Purnell M.P., Botella J.R., Plant Рhysiol, 2007, Vol. 143, No 1, pp. 530-539. DOI 10.1007/s00425-005-1510-z
Sarasketa A, Gonzalez-Moro M.B, Gonzalez-Murua C, Marino D., Front. Plant Sci, 2016, Vol. 7, pp. 1-12. DOI:10.3389/fpls.2016.00029
Yamaya T., Oaks A., Matumoto H., Plant Physiology, 1984, Vol. 76, pp. 1009-1013. DOI: 10.1104/pp.76.4.1009
Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Nikiti-na M.V. Igamberdiev A.U., Journal of Plant Physiology, 2015, Vol. 181, pp. 14-19. DOI: 10.1016/j.jplph.2015.03.012
Rudakov O.B., Selemenev V.F., Fizi-ko-himicheskie sistemy. Sorbat-sorbene-jeljujent v zhidkostnoj hromatografii, Voronezh, 2003, 240 p.
Davis B.J., Ann. N. Y. Acad. Sci, 1994, Vol. 121, pp. 404-427.
Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M., Anal. Chem, 1996, Vol. 68, pp. 850–858. DOI: 10.1021/ac950914h
Magalhaes J.R., Ju G.C., Rich P.J., Rhodes D., Plant Physiol, 1990, Vol. 94, pp. 647-656.
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., J. Biol. Chem, 1951, Vol. 193, pp. 265-275.
Lakin G.F. Biometrija. М., Vysh. shk., 1990, 351 p.
Eprintsev A.T., Anokhina G.B., Oya P.S., Dedov Y.I., Prikladnaja biohimija i mikrobiologija, 2021, Vol. 57, No 2, pp. 163-171.
