Применение ионообменной хроматографии для очистки глутатионредуктазы из печени крыс с парацетамол-индуцированным поражением печени для исследования некоторых каталитических свойств - Кравцова, Светлана Евгеньевна; Попова, Татьяна Николаевна; Крыльский, Евгений Дмитриевич; Матасова, Лариса Владимировна; Лебедева, Юлия Игоревна (Сорбционные и хроматографические процессы, 2023)
Целью работы явилось исследование активности глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.8.1.7.) при парацетамол-индуцированном поражении печени (ППП), а также выделение и очистка фермента с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии для оценки некоторых каталитических и регуляторных свойств. ППП моделировали путем однократного перорального введения ацетаминофена самцам белых лабораторных крыс (Rattus norvegicus) Wistar в дозе 1000 мг/кг массы тела, растворенного в 1 см3 вазелинового масла. Животные контрольной группы получали вазелиновое масло. Активность ГР определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Очистку фермента из печени крыс осуществляли с помощью фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации через сефадекс G-25, а также ионообменой хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Общее количество белка в пробах определяли при помощи набора BCA protein assay kit. В ходе работы была получена ГР из печени крыс с ППП со степенью очистки 33.3. С использованием метода двойных обратных координат Лайнуивера-Берка показано, что введение крысам парацетамола сопровождалось увеличением сродства фермента к НАДФН. Добавление в реакционную среду изоцитрата и глюкозо-6-фосфата, являющихся субстратами ферментов-поставщиков НАДФН для восстановления окисленного глутатиона, способствовало более выраженной активации ГР из печени животных с ППП по сравнению с контрольной группой. Наблюдаемое возрастание активности ГР при добавлении изоцитрата и глюкозо-6-фосфата было, по-видимому, связано с дополнительным активирующим действием данных соединений на фермент, реализующимся в условиях окисления восстановленного глутатиона при ППП. В то же время, введение в среду спектрофотометрирования цитрата приводило к более существенному снижению активности ГР относительно контрольных показателей. Наблюдаемые изменения свойств фермента могли быть связаны с наличием у цитрата антиоксидантных свойств, снижающих интенсивность свободнорадикального окисления при ППП. Таким образом, путём фракционирования, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе был получен очищенный препарат ГР из печени крыс с ППП, для которого продемонстрировано увеличение сродства к НАДФН и изменение регуляции активности под действием цитрата, изоцитрата и глюкозо-6-фосфата.