Физико-химические и каталитические свойства изоферментов аконитатгидратазы, полученных с помощью хроматографических методов, из печени крыс - Селиванова, Наталия Владимировна; Епринцев, Александр Трофимович (Сорбционные и хроматографические процессы, 2022)
Целью работы было получение с помощью хроматографических методов гомогенных изоферментов аконитатгидратазы (аконитаза, АГ, КФ 4.2.1.3), локализованных в митохондриях и цитоплазме гепатоцитов крыс, и изучение их физико-химических и каталитических свойств. Активность аконитазы определяли спектрофотометрически (при 240 нм). Для получения гомогенных препаратов АГ фермент очищали с использованием хроматографических способов, включающих на несколько этапов (высаливание гомогената сульфатом аммония, обессоливание или гель-фильтрация через сефадекс G-25 и ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Тоуореаrl и гель-хроматография на сефадексе G-200). Чистоту выделенных ферментных препаратов оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Белок в пробах измеряли по Лоури. Величину молекулярной массы АГ определяли методом денатурирующего электрофореза по Лэммли. Универсальное окрашивание белков проводили нитратом серебра. С целью подтверждения соответствия выделенных белков изоферментам аконитатгидратазы параллельно осуществляли специфическое проявление геля тетразолиевым методом с добавлением НАФД-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ) в качестве вспомогательного фермента. Применение хроматографических методов для очистки АГ из печени крыс Rattus norvegicus линии Wistar позволило получить гомогенные ферментативные препараты аконитатгидратазы с удельной активностью цитозольной формы – 1.736±0.024 Е/мг белка, а митохондриальной– 1.256±0.018 Е/мг белка, которые были использованы для исследования физико-химических и кинетических характеристик. Значения молекулярной массы цитоплазматической АГ из гепатоцитов крыс составили 91±5.2 кДа, а митохондриальной – 81±4.1 кДа. Выявлено, что обе формы аконитазы являются гомодимерами. Величина молекулярной массы (Mr ) субъединиц составляет 45 кДа для цитоплазматической фракции и 41 кДа – для АГ из митохондрий. Показано, что кинетические характеристики ферментативной реакции, которые катализируют цитоплазматический и митохондриальный изоферменты аконитатгидратазы, подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен. Установлено, что аконитаза имеет большее сродство к цис-аконитату, чем к цитрату. Показано, что изофермент из цитоплазмы имел рН оптимум 8.0±0.1, то есть находился в щелочной области по сравнению с АГ из митохондрий (7.4±0.1).