Выделение изоформ НАД+-зависимой малатдегидрогеназы кукурузы хроматографическими методами - Марина Олеговна Гатауллина; Александр Трофимович Епринцев (Сорбционные и хроматографические процессы, 2021)
НАД+-малатдегидрогеназа (НАД+-МДГ, КФ 1.1.1.37) является распространенным ферментом, играющим важную роль во многих метоболических процессах, таких как ЦТК, азотный обмен и транспорт НАДН. Различные условия среды сильно влияют на активность ферментов, активируя или ингибируя ее. Целью данной работы было исследование изменения активности малатдегидрогеназ при действии различных температур.В качестве объекта исследования выступали 10-дневные проростки Zea mays, выращенные гидропонным методом. Изоферменты малатдегидрогеназ из листьев кукурузы были очищены с помощью четырехстадийной очистки, включавшей в себя стадии гомогенизирования растительного материала, осаждения белка сульфатом аммония в концентрации 25-80% насыщения, гель-фильтрации через сефадекс G-25 и ионообменной хроматографии на колонке, заполненной ДЭAЭ-Sephacel. Элюция проводилась линейным градиентом хлористого натрия в концентрации от 0 до 150 мМ, в процессе которой собирались фракции с малатдегидрогеназной активностью. Измерение активности ферментов проводилось спектрофотометрически по определению скорости образования или расходования НАДН при длине волны 340 нм. Электрофоретические исследования проводили в полиакриламидном геле с последующим универсальным окрашиванием белков нитратом серебра или специфическим проявлением ферментативной активности тетразолиевым методом с индукцией образования нерастворимого диформазана в месте расположения фермента.Препарат цитоплазматической МДГ характеризовался удельной активностью 256 Е/мг белка и степенью очистки 115. Выход составил 3.5 %. Удельная активность митохондриальной формы исследуемого фермента равнялась 155 Е/мг белка при степени очистки 67 и выходе 2%. Пероксисомальная форма МДГ характеризовалась удельной активностью 180 Е/мг белка, степенью очистки 78 и выходом 1%. Было показано незначительное влияние получасовой инкубации фермента при 7, 15, 30оС. Определены температурные оптимумы для прямой и обратной реакций трех форм малатдегидрогеназ: 25 и 45оС для цитоплазматической и 30 и 45оС для митохондриальной. Температурный оптимум пероксисомальной формы для реакций окисления малата и восстановления оксалоацетата одинаков и равняется 35оС.