Оптимизация метода выделения нуклеиновых кислот из кефира с помощью сорбента на основе диоксида кремния

Аннотация

Методы выделения нуклеиновых кислот, основанные на использовании сорбционных носителей, являются самыми распространенными. Общий принцип методов твердофазной экстракции основывается на использовании силики, чьи уникальные свойства обеспечивают селективное связывание ДНК и РНК. Цель работы заключалась в проведении анализа качества выделительных систем на основе сорбции с применением гуанидин тиоционата различной концентрации и 4 типов детергентов в составе лизирующего раствора при экстракции нуклеиновых кислот из кефира, как пищевого кисломолочного продукта, содержащего бактериальные и грибковые клетки.

В качестве объекта исследования был использован коммерчески доступный кисломолочный продукт «Кефир» с содержанием бактерий не менее 10⁷ КОЕ/г и дрожжей не менее 10⁴ КОЕ/г. Для выделения ДНК использовали 99% силику (Sigma-Aldrich, США). В рамках эксперимента рассматривались 3 варианта концентраций гуанидин тиоционата – 3.5 М, 5 М и 6.5 М, а также 4 варианта детергентов – 1% Triton Х-100, 1% Tween 20, 1% Tween 80 и 1% CTAB. Таким образом, экстракция ДНК осуществлялась 12 различными вариантами. ДНК, полученную после экстракции, визуализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Концентрацию ДНК измеряли с помощью флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США). Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием Taq-полимеразы на приборе CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США). Статистическая обработка данных проводилась с использованием дисперсионного анализа ANOVA в программе STATISTICA.

При проведении электрофореза в агарозном геле было установлено, что использование концентраций гуанидин тиоционата 5 М и 6.5 М способствовало получению более выраженных полос рРНК на электрофореграмме в случае применения Tween 80, а при использовании Tween 20 оптимальная концентрация гуанидин тиоционата для экстракции ДНК составила 5 М.

Анализ влияния детергентов на качество выделения ДНК показал, что минимальная концентрация экстрагированной ДНК была получена в результате использования CTAB и составляла 1.03 нг/мкл. Применение в качестве детергента Triton Х-100 позволило получить концентрацию ДНК в 5.9 раз выше, чем с помощью детергента CTAB (р<0.001). Значения, полученные в результате экстракции с использованием Tween 80 и Tween 20, превышали значения концентраций при использовании CTAB в 3.1 и 3.9 раза соответственно (р<0.05).

Проведение Real-Time PCR для оценки параметра порогового цикла (Ct) показало, что полученные значения Ct с праймерами ITS1 и ITS4 во всех вариантах экстракции ДНК не позволяют оценить качество выделения нуклеиновых кислот из грибов. Анализ Ct с праймерами 337F и 1100R позволяет предположить, что оптимальным значением концентрации гуанидин тиоционата является 5 М (среднее значение Ct по всем детергентам составляло 25.0).

По результатам эксперимента было установлено, что при выделении нуклеиновых кислот из кефира необходимо использовать гуанидин тиоционат в концентрации 5 М или 6,5 М. Концентрация выделенной ДНК была выше при использовании Triton Х-100 и Tween 20 в качестве детергента. Использование Tween 20 или Tween 80 в качестве детергентов значительно повышало фракцию РНК в препарате нуклеиновых кислот.