Оптимизация метода выделения нуклеиновых кислот из кефира с помощью сорбента на основе диоксида кремния

  • Екатерина Юрьевна Нестерова Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж, Россия
  • Мария Ивановна Гладких Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж, Россия
  • Михаил Юрьевич Сыромятников Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия
  • Василий Николаевич Попов Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж, Россия
Ключевые слова: выделение ДНК, детергент, гуанидин тиоционат, Real-Time PCR.

Аннотация

Методы выделения нуклеиновых кислот, основанные на использовании сорбционных носителей, являются самыми распространенными. Общий принцип методов твердофазной экстракции основывается на использовании силики, чьи уникальные свойства обеспечивают селективное связывание ДНК и РНК. Цель работы заключалась в проведении анализа качества выделительных систем на основе сорбции с применением гуанидин тиоционата различной концентрации и 4 типов детергентов в составе лизирующего раствора при экстракции нуклеиновых кислот из кефира, как пищевого кисломолочного продукта, содержащего бактериальные и грибковые клетки.

В качестве объекта исследования был использован коммерчески доступный кисломолочный продукт «Кефир» с содержанием бактерий не менее 107 КОЕ/г и дрожжей не менее 104 КОЕ/г. Для выделения ДНК использовали 99% силику (Sigma-Aldrich, США). В рамках эксперимента рассматривались 3 варианта концентраций гуанидин тиоционата – 3.5 М, 5 М и 6.5 М, а также 4 варианта детергентов – 1% Triton Х-100, 1% Tween 20, 1% Tween 80 и 1% CTAB. Таким образом, экстракция ДНК осуществлялась 12 различными вариантами. ДНК, полученную после экстракции, визуализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Концентрацию ДНК измеряли с помощью флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США). Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием Taq-полимеразы на приборе CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США). Статистическая обработка данных проводилась с использованием дисперсионного анализа ANOVA в программе STATISTICA.

При проведении электрофореза в агарозном геле было установлено, что использование концентраций гуанидин тиоционата 5 М и 6.5 М способствовало получению более выраженных полос рРНК на электрофореграмме в случае применения Tween 80, а при использовании Tween 20 оптимальная концентрация гуанидин тиоционата для экстракции ДНК составила 5 М.

Анализ влияния детергентов на качество выделения ДНК показал, что минимальная концентрация экстрагированной ДНК была получена в результате использования CTAB и составляла 1.03 нг/мкл. Применение в качестве детергента Triton Х-100 позволило получить концентрацию ДНК в 5.9 раз выше, чем с помощью детергента CTAB (р<0.001). Значения, полученные в результате экстракции с использованием Tween 80 и Tween 20, превышали значения концентраций при использовании CTAB в 3.1 и 3.9 раза соответственно (р<0.05).

Проведение Real-Time PCR для оценки параметра порогового цикла (Ct) показало, что полученные значения Ct с праймерами ITS1 и ITS4 во всех вариантах экстракции ДНК не позволяют оценить качество выделения нуклеиновых кислот из грибов. Анализ Ct с праймерами 337F и 1100R позволяет предположить, что оптимальным значением концентрации гуанидин тиоционата является 5 М (среднее значение Ct по всем детергентам составляло 25.0).

По результатам эксперимента было установлено, что при выделении нуклеиновых кислот из кефира необходимо использовать гуанидин тиоционат в концентрации 5 М или 6,5 М. Концентрация выделенной ДНК была выше при использовании Triton Х-100 и Tween 20 в качестве детергента. Использование Tween 20 или Tween 80 в качестве детергентов значительно повышало фракцию РНК в препарате нуклеиновых кислот.

Скачивания

Данные скачивания пока не доступны.

Биографии авторов

Екатерина Юрьевна Нестерова, Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж, Россия

младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий, ВГУИТ, Воронеж. Аспирант кафедры генетики, цитологии и биоинженерии ВГУ, Воронеж, Россия

Мария Ивановна Гладких, Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж, Россия

младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий, ВГУИТ, Воронеж, Россия

Михаил Юрьевич Сыромятников, Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия

ведущий научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий, Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж. Доцент кафедры генетики, цитологии и биоинженерии ВГУ, Воронеж, Россия

Василий Николаевич Попов, Воронежский государственный университет инженерных технологий, Воронеж, Россия

ректор Воронежского государственного университета инженерных технологий, Воронеж. Заведующий кафедрой генетики, цитологии и биоинженерии ВГУ, Воронеж, Россия

Литература

Cheng H.R., Jiang N. Extremely Rapid Extraction of DNA from Bacteria and Yeasts. Biotechnol. Lett. 2006; 28: 55-59. https://doi.org/10.1007/s10529-005-4688-z

Niemi R.M., Heiskanen I., Wallenius K. et al. Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGE analysis of bacterial consortia. J. Microbiol. Methods. 2001; 45: 155-165. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(01)00253-6

Madhu B., Lakdawala M.F., Gumien-ny T.L. Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA. J. Vis. Exp. 2022; 184. https://doi.org/10.3791/63716

Muller F.M., Werner K.E., Kasai M. et al. Rapid extraction of genomic DNA from medically important yeasts and filamentous fungi by highspeed cell disruption. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 1625-1629. https://doi.org/10.1128/JCM.36.6.1625-1629.1998

Paul R., Ostermann E., Wei Q. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases. Biosens. Bioelectron. 2020; 169: 112592. https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112592

Greathouse K.L., Sinha R., Vogtmann E. DNA extraction for human microbiome studies: the issue of standardization. Genome Biol. 2019; 20: 212. https://doi.org/ 10.1186/s13059-019-1843-8

Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990; 28: 495-503. https://doi.org/ 10.1128/jcm.28.3.495-503.1990

Cady N.C., Stelick S., Batt C.A. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures. Biosensors & Bioelectronics. 2003; 19: 59-66. https://doi.org/10.1016/s0956-5663(03)00123-4

Rimola A., Costa D., Sodupe M. et al. Silica surface features and their role in the adsorption of biomolecules: computational modeling and experiments. Chemical Re-views. 2013; 113: 4216-4313. https://doi.org/10.1021/cr3003054

Zhang Y., Cremer P.S. Interactions between macromolecules and ions: the Hofmeister series. Current Opinion in Chemical Biology. 2006; 10: 658-663. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2006.09.020

Poeckh T., Lopez S., Fuller A.O. et al. Adsorption and elution characteristics of nucleic acids on silica surfaces and their use in designing a miniaturized purification unit. Analytical Biochemistry. 2008; 373: 253-262. https://doi.org/10.1016/j.ab.2007.10.026

Günal G., Kip Ç., Eda Öğüt S. et al. Comparative DNA isolation behaviours of silica and polymer based sorbents in batch fashion: monodisperse silica micro-spheres with bimodal pore size distribution as a new sorbent for DNA isolation. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol. 2018; 46: 178-184. https://doi.org/10.1080/21691401.2017.1304404

Chen Y., Guo Z., Wang X. et al. Sample preparation. J. Chromatogr. A. 2008; 1184: 191-219. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2007.10.026

Campos P.F., Gilbert M.T.P. DNA Extraction from Keratin and Chitin. Meth-ods Mol. Biol. 2019; 1963: 57-63. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9176-1_7

Linke D. Detergents: an overview. Methods Enzymol. 2009; 463: 603-617. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(09)63034-2

Lõoke M., Kristjuhan K., Kristjuhan A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011; 50: 325-328. https://doi.org/10.2144/000113672

Barazesh A., Sarkari B., Ebrahimi S. et al. DNA extraction from hydatid cyst protoscolices: Comparison of five different methods. Vet. World. 2018; 11: 231-234. https://doi.org/10.14202/vetworld.2018.231-234

Chen F., Ye J., Chio C. et al. A simplified quick microbial genomic DNA extraction via freezethawing cycles. Mol. Biol. Rep. 2020; 47: 703-709. https://doi.org/10.1007/s11033-019-05176-w

Teyssier N.B., Chen A., Duarte E.M. et al. Optimization of whole-genome sequencing of Plasmodium falciparum from low-density dried blood spot samples. Malar. J. 2021; 20: 116. https://doi.org/10.1186/s12936-021-03630-4

Demeke T., Ratnayaka I., Phan A. Effects of DNA Extraction and Purification Methods on Real-Time Quantitative PCR Analysis of Roundup Ready Soybean. J. AOAC Int. 2009; 92: 1136-1144. https://doi.org/10.1093/jaoac/92.4.1136

Kuhn R., Böllmann J., Krahl K. et al. Comparison of ten different DNA extraction procedures with respect to their suitability for environmental samples. J. Microbiol. Methods. 2017; 143: 78-86. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2017.10.007

Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990; 28: 495-503. https://doi.org/10.1128/jcm.28.3.495-503.1990

White T.J., Bruns T., Lee S. et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press, 1990, vol. 18, P. 315-322.

Techo S., Shiwa Y., Tanaka N. et al. Enterococcus florum sp. nov., isolated from a cotton flower (Gossypium hirsutum L.) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2019; 69: 2506-2513. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.003524

Опубликован
2023-01-17
Как цитировать
Нестерова, Е. Ю., Гладких, М. И., Сыромятников, М. Ю., & Попов, В. Н. (2023). Оптимизация метода выделения нуклеиновых кислот из кефира с помощью сорбента на основе диоксида кремния. Сорбционные и хроматографические процессы, 22(6), 893-900. https://doi.org/10.17308/sorpchrom.2022.22/10896