Физико-химические и кинетические свойства коллагеназы, нативной и адсорбированной на хитозане
Аннотация
Одним из актуальных направлений биотехнологии и медицины является разработка высокостабильных биопрепаратов на основе иммобилизованных ферментов. Методом сорбционной иммобилизации были получены гетерогенные биокатализаторы на основе коллагеназы (КФ 3.4.24.3) из Clostridium histolyticum и среднемолекулярного (200 кДа) и высокомолекулярного (350 кДа) хитозанов. Целью работы являлось изучение физико-химических и кинетических свойств свободной и иммобилизованной на матрице хитозана коллагеназы из Clostridium histolyticum.
Классическими биофизическими и биохимическими методами были изучены физико-химические и кинетические свойства энзима в растворимом и иммобилизованном состояниях. Показано, что у нативной коллагеназы максимальная активность наблюдается при 37ºС, а у иммобилизованного на среднемолекулярном и высокомолекулярном хитозанах фермента – при 40ºС. Сорбционная иммобилизация биокатализатора на матрице хитозанов способствовала повышению его стабильности при инкубации в диапазоне температур 40-70°С. После инкубации при 80 и 90 °С не были выявлены существенные различия в активности растворимой и иммобилизованной коллагеназы. При исследовании зависимости протеазной активности фермента от кислотности среды в диапазоне рН от 5.0 до 9.0 было установлено, что максимум каталитической способности растворимой коллагеназы наблюдается при значении рН, равном 7.5. Иммобилизованный на среднемолекулярном и высокомолекулярном хитозанах биокатализатор оказался высокоактивным при рН 6.0-7.5. Каталитическая способность фермента в свободном и адсорбированном состояниях заметно снизилась при рН 8.0, а при рН 9.0 растворимая и иммобилизованная на среднемолекулярном и высокомолекулярном хитозанах коллагеназа была полностью инактивирована. Максимальная скорость ферментативной реакции нативного и иммобилизованного на хитозане биокатализаторов наблюдалась при концентрации субстрата, равной 0.04 мМ. Был произведен расчет кажущихся значений V´max и K´m. Иммобилизация коллагеназы на среднемолекулярном и высокомолекулярном хитозанах не привела к снижению максимальной скорости реакции и изменению степени сродства фермента к субстрату.
Используя метод динамического светорассеяния, мы подтвердили, что структура коллагеназы в растворе наиболее устойчива при рН 7.0-8.0, так как именно в данном диапазоне значений [H+] выявлено наибольшее содержание частиц, соответствующих размеру нативной коллагеназы, и наименьшее содержание ее агрегатов. Оптимальной температурой, при которой коллагеназа была наиболее стабильна (отсутствовали процессы автолиза, а агрегация частиц была минимальна), можно считать 46°С.
Скачивания
Литература
Bhagwat P.K., Dandge P.B., Colla-gen and collagenolytic proteases: a review, Biocatal. Agric. Biotechnol, 2018; 15: 43-55. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2018.05.005
Duarte A.S., Correia A., Esteves A.C., Bacterial collagenases – a review, Crit. Rev. Microbiol., 2016; 42: 106-126. https://doi.org/10.3109/1040841X.2014.904270
Alipour H., Raz A., Zakeri S., Dja-did N.D., Therapeutic applications of col-lagenase (metalloproteases): a review, Asian Pac. J. Trop. Biomed., 2016; 6: 975-981. https://doi.org/10.1016/j.apjtb.2016.07.017
Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 1976; 13: 29-83. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)61797-5
Mandl I., MacLennon J.D., Howes E.L., Isolation and characterization of pro-teinase and collagenase from Cl. Histolyti-cum, J. Clin. Invest., 1953; 32: 1323-1329. https://doi.org/10.1172/JCI102861
Mandl I., Zipper H., Ferguson L.T., Clostridium histolyticum collagenase: its purification and properties, Arch. Biochem. Biophys., 1958; 74: 465-475. https://doi.org/
1016/0003-9861(58)90017-1
Grant N.H., Alburn H.E., Studies on the collagenases of Clostridium histolyti-cum, Arch. Biochem.Biophys., 1959; 82: 245-255. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90120-1
Mandl I., Keller S., Manahan J., Multiplicity of Clostridium histolyticum collagenases, Biochemistry, 1964; 3: 1737-1741. https://doi.org/10.1021/bi00899a026
Yoshida E., Noda H., Isolation and characterization of collagenases I and II from Clostridium histolyticum, Biochim. Biophys. Acta., 1965; 105: 562-574. https://
doi.org/10.1016/s0926-6593(65)80239-9
Kono T., Purification and partial characterization of collagenolytic enzymes from Clostridium histolyticum, Biochemis-try, 1968; 7: 1106-1114. https://doi.org/10.1021/bi00843a031
Harper E., Kang A.H., Studies on the specificity of bacterial collagenase, Bi-ochem. Biophys. Res. Commun., 1970; 41: 482-487. https://doi.org/10.1016/0006-291x(70)90531-0
Lwebuga-Mukasa J.S., Harper E., Taylor P., Collagenase enzymes from Clos-tridium: characterization of individual en-zymes, Biochemistry, 1976: 15: 4736-4741. https://doi.org/10.1021/bi00666a031
Bond M.D., Van Wart H.E., Charac-terization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum, Biochemis-try, 1984; 23: 3085-3091. https://doi.org/10.1021/bi00308a036
Bond M.D., Van Wart, H.E., Purifi-cation and separation of individual colla-genases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography, Biochemis-try, 1984; 23: 3077-3085. doi: 10.1021/bi00308a035
Bond M.D., Van Wart H.E., Rela-tionship between the individual colla-genases of Clostridium histolyticum: evi-dence for evolution by gene duplication, Biochemistry, 1984; 23: 3092-3099. https://doi.org/
1021/bi00308a037
Toledano M., Osorio R., Osorio E., Aguilera F.S., Yamauti M., Pashley D.H., Tay F., Effect of bacterial collagenase on resin-dentin bonds degradation, J. Mater. Sci. Mater. Med., 2007; 18: 2355-2361. https://doi.org/10.1007/s10856-007-3161-z.
Metzmacher I., Ruth P., Abel M., Friess W., In vitro binding of matrix metal-loproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, and bac-terial collagenase on collagenous wound dressings, Wound Repair Regen., 2007; 15: 549-555. https://doi.org/10.1111/j.1524-475X.2007.00263.x
Velmurugan P., Jonnalagadda R.R., Nair B.U., Engineering D-amino acid con-taining collagen like peptide at the cleav-age site of Clostridium histolyticum colla-genase for its inhibition, PLoS ONE, 2015; 10: e0124398. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124398
Holyavka M., Artyukhov V., Ko-valeva T., Structural and functional proper-ties of inulinases: A review, Biocatalysis and Biotransformation, 2016; 34(1): 1-17.
Artyukhov V.G., Kovaleva T.A., Kholyavka M.G., Bityutskaya L.A., Grech-kina M.V., Thermal inactivation of free and immobilized inulinase, Applied Bio-chemistry and Microbiology, 2010; 46(4): 385-389.
Holyavka M.G., Kondratyev M.S., Lukin A.N., Agapov B.L., Artyukhov V.G., Immobilization of inulinase on KU-2 ion-exchange resin matrix, International Jour-nal of Biological Macromolecules, 2019; 138: 681-692. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.07.132
Ahmad A., Javed M.R., Ibrahim M., Sajid A., Hussain K., Kaleem M., Fatima H.M., Nadeem H., Methods of enzyme immobilization on various supports, Mate-rials Research Foundations, 2019; 44: 1-28. https://doi.org/10.21741/9781644900079-1
Secundo F., Conformational chang-es of enzymes upon immobilization, Chem.Soc. Rev., 2013; 42: 6250-6261. https://doi.org/10.1039/c3cs35495d
Holyavka M.G., Kondratyev M.S., Samchenko A.A., Kabanov A.V., Komarov V.M., Artyukhov V.G., In silico design of high-affinity ligands for the immobilization of inulinase, Computers in Biology and Medicine, 2016; 71: 198-204. https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2016.02.015
Lyu X., Gonzalez R., Horton A., Li T., Immobilization of enzymes by poly-meric materials, Catalysts, 2021; 11: 1211. https://doi.org/10.3390/catal11101211
Holyavka M., Faizullin D., Koroleva V., Olshannikova S., Zakhartchenko N., Zuev Yu., Kondratyev M., Zakharova E., Artyukhov V., Novel biotechnological formulations of cysteine proteases, immobilized on chitosan. Struc-ture, stability and activity, International Journal of Biological Macromolecules, 2021; 180: 161-176. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2021.03.016
Trizna E.Yu., Baydamshina D.R., Kholyavka M.G., Sharafutdinov I.S., Hairutdinova A.R., Khafizova F.A., Za-kirova E.Yu., Hafizov R.G., Kayumov A.R., Soluble and immobilized papain and trypsin as destroyers of bacterial biofilms, Genes and Cells, 2015; 10(3): 106-112.
Baidamshina D.R., Koroleva V.A., Olshannikova S.S., Trizna E.Yu., Bogachev M.I., Artyukhov V.G., Holyavka M.G., Kayumov A.R., Biochemical properties and anti-biofilm activity of chitosan-immobilized papain, Marine Drugs, 2021; 19(4): 197. https://doi.org/10.3390/md19040197
Slováková M., Kratochvilová V., Palarcik J., Metelka R., Dvorakova P., Srbová J., Munzarová M., Bílková Z., Chi-tosan nanofibers and nanoparticles for im-mobilization of microbial collagenase, XXIV International Congress IFATCC, 2016; 193-198.
Badoei-dalfard A., Monemi F., Has-sanshahian M., One-pot synthesis and bio-chemical characterization of a magnetic collagenase nanoflower and evaluation of its biotechnological applications, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2022; 211: 112302. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.112302
Garcìa-Carreño F.L., The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial charac-terization, and the effect of feed on their composition, Comp. Biochem. Physiol. B: Biochem. Mol. Biol., 1992; 103: 575-578.
Kharat S.J., Density, viscosity and ultrasonic velocity studies of aqueous solu-tions of sodium acetate at different temper-atures, Journal of Molecular Liquids, 2008; 140: 10-14. https://doi.org/10.1016/j.molliq.2007.12.006
Ohbayashi N., Yamagata N., Goto M., Watanabe K., Yamagata Y., Murayama K., Applied and Environmental Microbiol-ogy, 2012; 78(16): 5839-5844.
