Оценка образования РНК-интерферирующего комплекса с miR775А электрофоретическим методом в листьях кукурузы при нормоксии и гипоксии
Аннотация
. Недостаток кислорода наиболее чувствительно отражается на окислительных процессах клетки, в частности митохондриальном дыхании, и требует координации клеточного метаболизма. Одним из инструментов молекулярной эпигенетической регуляции служат микроРНК – класс некодирующих малых молекул РНК (20-22 нт), регулирующие экспрессию целевых генов на посттранскрипционном уровне путем ингибирования трансляции или расщепления их мРНК. Как известно, микроРНК могут действовать по пути РНК-интерференции, или связываться с комплексом РНК-индуцированного транскрипционного сайленсинга (RITS). Исследование роли микроРНК в адаптивной реакции клеточного метаболизма на гипоксический стресс изменения при гипоксии, как механизма молекулярного контроля, вызывают особый интерес. Применение фенол-хлороформной экстракции со специфическим осадителем для рибонуклеиновых кислот LiCl позволило получить из листьев кукурузы суммарную клеточную РНК. Полученные препараты РНК были хорошего качества, о чем свидетельствует наличие 2х четко выраженных полос 28S и 18S рРНК и отсутствие следов деградации. Полученные препараты суммарной клеточной РНК использовали в качестве матрицы при оценке формирования РНК-интерферирующих комплексов, образованных в виде дуплексных элементов РНК:РНК по принципу комплементарности между микроРНК775А и мРНК-мишенью Для оценки образования РНК-интерферирующего комплекса с miR775А применяли метод аналитического электрофореза в агарозном геле со специфичным флуоресцентным зондом, содержащим ROX. Данный метод позволил выявить соотношение количества образовавшихся РНК-интерферирующих комплексов клеточной мРНК с miR775А, разделенных на основе их молекулярных масс, в образцах при развитии гипоксических условий. Электрофорез в агарозном геле с последующей денситометрией показал наличие только одного интерферирующего комплекса с элекрофоретической подвижностью 0.23-0.25 ед. Результаты показали, что miR775A взаимодействует с одной мРНК-мишенью в клетках листьев кукурузы в норме и при гипоксии. Количественная оценка интенсивности флуоресценции образованного комплекса мРНК-miR775A-зонд по эмиссии ROX свидетельствует об увеличении анализируемого показателя в образцах, выделенных из листьев кукурузы в условиях гипоксического стрессе.
Скачивания
Литература
Hou, Y., Jiang, F., Zheng, X., Wu Z. Identification and analysis of oxygen re-sponsive microRNAs in the root of wild tomato (S. habrochaites). BMC Plant Biol. 2019; 19: 100. https://doi.org/10.1186/s12870-019-1698-x
Liu Z., Kumari S., Zhang L., Zheng Y., Ware D. Characterization of miRNAs in response to short-term waterlogging in three inbred lines of Zea mays./ PLoS One. 2012; 7: e39786. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039786
Bailey-Serres J., Chang R. Sensing and signalling in response to oxygen depri-vation in plants and other organisms. An-nals of Botany. 2005; 96: 507-518. https://doi.org/10.1093/aob/mci206
Vazquez F. Arabidopsis endogenous small RNAs: highways and byways. Trends in Plant Science. 2006; 11: 460-468. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2006.07.006
Brodersen P., Sakvarelidze-Achard L., Bruun-Rasmussen M., Dunoyer P., Yamamoto Y.Y., Sieburth L., Voinnet O. Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs. Science. 2008; 320: 1185-1190. https://doi.org/10.1126/science.1159151
Betti F., Ladera-Carmona M. J., Perata P., Loreti E. RNAi Mediated Hypox-ia Stress Tolerance in Plants. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21: 9394. https://doi.org/10.3390/ijms21249394
Mishra V., Singh A., Gandhi N., Das S.S., Yadav S., Kumar A., Sarkar A.K. A unique miR775-GALT9 module regu-lates leaf senescence in Arabidopsis during post-submergence recovery by modulating ethylene and the abscisic acid pathway. Development. 2022; 149: dev199974. https://doi.org/10.1242/dev.199974
Riffo-Campos A.L., Riquelme I., Brebi-Mieville P. Tools for sequence-based miRNA target prediction: what to choose? Int. J. Mol. Sci. 2016; 17: 1987. https://doi.org/10.3390/ijms17121987
Kulkarni S.R., Vaneechoutte D., de Velde J.V., Vandepoele K. TF2Network: predicting transcription factor regulators and gene regulatory networks in Arabidop-sis using publicly available binding site information. Nucl. Acids Res. 2018; 46: e31. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1279
Wani SH, Tripathi P, Zaid A, Challa G.S., Kumar A., Kumar V., Upadhyay J., Joshi R., Bhatt M. Transcriptional regula-tion of osmotic stress tolerance in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Mol. Biol. 2018; 97: 469-487. https://doi.org/10.1007/s11103-018-0761-6
Tyagi S., Sharma S., Ganie S.A., Tahir M., Mir R.R., Pandey R. Plant mi-croRNAs: biogenesis, gene silencing, web-based analysis tools and their use as mo-lecular markers. 3 Biotech. 2019; 9: 413. https://doi.org/10.1007/s13205-019-1942-y
Ding J., Zhou S., Guan J. Finding microRNA targets in plants: current status and perspectives. Genom Proteom Bioin-form. 2012; 10: 264-275. https://doi.org/10.1016/j.gpb.2012.09.003
Morita T., Maki K., Aiba H. Detec-tion of sRNA–mRNA Interactions by Elec-trophoretic Mobility Shift Assay. Methods Mol. Biol. 2012; 905: 235-244. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-949-5_15
Paugh S.W., Coss D.R., Bao J., Laudermilk L.T., Grace C.R., Ferreira A.M., Brett Waddell M., Ridout G., Naeve D., Leuze M., LoCascio P.F., Panetta J.C., Wilkinson M.R., Pui C-H., Naeve C.W., Uberbacher E.C., Bonten E.J., Evans W.E. MicroRNAs Form Triplexes with Double Stranded DNA at Sequence-Specific Bind-ing Sites; a Eukaryotic Mechanism via which microRNAs Could Directly Alter Gene Expression. PLoS Comput. Biol. 2016; 12: e1004744. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004744
Eprintsev A.T., Anokhina G.B., Ga-taullina M.O., Fedorin D.N. Rol' epigenet-icheskikh mekhanizmov v regulyatsii ak-tivnosti 2-OGDG i MDG v list'yakh kuku-ruzy (Zea mays L.) pri gipoksii. Fiziologiya rasteniy. 2021; 68: 187-193. https://doi.org/10.31857/S0015330321010061
Chomczynski P., Sacchi N. Sin-glestep-method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987; 162: 156-159. https://doi.org/10.1006/abio.1987.9999
Lakin G.F. Biometrics. M.: Higher school, 1990. 351p. (In Russ.)
Voinnet O. Origin biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell. 2009; 136: 669-687. https://doi.org/10.1016/
j.cell.2009.01.046
Bhattacharjee S., Roche B., Martienssen R.A. RNA-induced initiation of transcriptional silencing (RITS) complex structure and function. RNA Biology. 2019; 16: 1133-1146. https://doi.org/10.1080/15476286.2019.1621624
Moldovan D., Spriggs A., Yang J., Pogson B.J., Dennis E.S., Wilson I.W. Hy-poxia-responsive microRNAs and trans-acting small interfering RNAs in Arabidop-sis. J. Exp. Bot. 2010; 61: 165-177. https://doi.org/10.1093/jxb/erp296
Ambawat S., Sharma P., Yadav N.R., Yadav R.C. MYB transcription factor genes as regulators for plant responses: an overview. Physiol. Mol. Biol. Plants. 2013; 19: 307-321. https://doi.org/10.1007/s12298-013-0179-1
Hoeren F.U., Dolferus R., Wu Y., Peacock W.J., Dennis E.S. Evidence for a role for AtMYB2 in the induction of the Arabidopsis alcohol dehydrogenase gene (ADH1) by low oxygen. Genetics. 1998; 149: 479-490. https://doi.org/10.1093/genetics/149.2.479
Gautam A. Lithium Chloride-Based Isolation of RNA. In: DNA and RNA Isola-tion Techniques for Non-Experts. Tech-niques in Life Science and Biomedicine for the Non-Expert. Springer, Cham. 2022: 69-72. https://doi.org/10.1007/978-3-030-94230-4_8
