Оптимизация методики получения рекомбинантных двухдоменных лакказ

  • Любовь Игоревна Трубицина Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН – обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино
  • Иван Васильевич Трубицин Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН – обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино
  • Александр Викторович Лисов Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН – обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино
Ключевые слова: двухдоменная лакказа, фермент, очистка, аффинная хроматография.

Аннотация

Лакказы (К.Ф. 1.10.3.2) – ферменты из семейства медьсодержащих оксидаз, активный центр
которых содержит 4 атома меди. Лакказы способны окислять широкий спектр органический и неорганических соединений. Ферменты данного класса используют в биотехнологических целях (в целлюлозно-бумажной, текстильной, пищевой промышленности). В структурном отношении лакказы
подразделяют на 2 группы: двухдоменные (2д) и трёхдоменные (3д) ферменты. Характерные особенности 2д лакказ – устойчивость к специфичным ингибиторам семейства медьсодержащих оксидаз, а также высокая термостабильность. Окислительно-восстановительный потенциал 2д лакказ ниже потенциала 3д ферментов. Однако он может быть повышен благодаря использованию редоксмедиаторов. Высокая термостабильность и устойчивость к действию ингибиторов – важные критерии отбора ферментов для нужд биотехнологии. Также важным критерием для биотехнологически значимых ферментов является стоимость их производства. Если получение фермента требует значительных затрат, а выход конечного продукта низок, то производство фермента нецелесообразно.
Поэтому целью данной работы является оптимизация процесса получения двухдоменных рекомбинантных лакказ, экспрессируемых гетерологично в штамме Escherichia coli, с расчетами стоимости конечного продукта (на примере ферментов SgfSL, SvSL и SaSL, полученных в нашей лаборатории). Ранее три рекомбинантные двухдоменные лакказы были клонированы и  экспрессированы в штамме Escherichia coli M15 (pRep4). В данной работе мы исследовали влияние различных факторов на максимальный выход лакказ: влияние ионов меди, концентрации индуктора, условий культивирования, оптической плотности культуры, и других условий. Было показано, что оптимальная концентрация ионов меди составляет 1 мМ, а оптимальная концентрация индуктора ИПТГ составляет 0,1мМ (при этом отсутствует эффект агрегирования и наблюдается высокий выход ферментов). Мы подтвердили выводы коллег о том, что для получения лакказ, максимально насыщенных ионами меди, необходимы микроаэробные условия культивирования. Без стадии микроаэробного роста удельная активность очищенных ферментов снижается в 2 раза. Было обнаружено, что слишком высокая скорость перемешивания клеток при индукции синтеза лакказ приводит к агрегации ферментов. Скорость перемешивания, при которой лакказы не агрегируют, составляет 50-100 об/мин.
Выводы: был разработан и оптимизирован процесс получения двухдоменных бактериальных
рекомбинантных лакказ. Максимальный выход ферментов составил 180 мг белка с литра среды. Фер-
мент имел низкую себестоимость (16-32 евро за 1 г белка).

 

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Baldrian P. // FEMS Microbiol Lett. 2006. Vol. 30. No 2. pp. 215-242.
2. Claus H. // Arch Microbiol. 2003. Vol. 179. No 3. pp. 145-150.
3. Otto B., Schlosser D. // Planta. 2014. Vol. 240. No 6. pp. 1225-1236.
4. Lisov A.V., Zavarzina A.G., Zavarzin A.A., Leontievsky A.A. // FEMS Microbiol Lett.
2007. Vol. 275. No 1. pp. 46-52.
5. Thurston C.F. // Microbiology. 1994. Vol. 140. pp. 19-26.
6. Sterjiades R., Dean J.F., Eriksson K.E. // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. No 3. pp. 1162-1168.
7. Endo K., Hosono K., Beppu T., Ueda K. // Microbiology. 2002. Vol. 148. pp. 1767-1776.
8. Lu L., Zeng G., Fan C., Zhang J. et al. // Appl Environ Microbiol. 2014. Vol. 80. No 11. pp. 3305-3314.
9. Minussi R.C., Pastore G.M., Duran N. // Trends Food Sci Tech. 2002. Vol. 13. No 6-7. рр. 205-216.
10. Dominguez A., Couto S.R., Sanroman M.A. // World J Microbiol Biotechnol. 2005. Vol. 21. No 4. pp. 405-409.
11. Couto S.R., Herrera J.L.T. // Biotechnol Adv. 2006. Vol. 24. No 5. pp. 500-513.
12. Trubitsina L.I., Tishchenko S.V., Gabdulkhakov A.G., Lisov A.V. et al. // Biochimie.
2015. Vol. 112. pp. 151-159.
13. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Trubitsina L., Lisov A. et al. // Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 2015. Vol. 71. pp. 1200-1204.
14. Lisov A.V., Trubitsina L.I., Lisova Z.A., Trubitsin I.V. et al. // Process biochemistry. 2019. Vol. 76. pp. 128-135.
15. Durao P., Chen Z., Fernandes A.T., Hildebrandt P. et al. // J Biol Inorg Chem. 2008. Vol. 13. No 2. pp. 183-193.
16. Gunne M., Urlacher V.B. // PLoS One. 2012. Vol. 7. No 12. pp. e52360.

Скачивания

Данные скачивания пока не доступны.

Биографии авторов

Любовь Игоревна Трубицина, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН – обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино

к.б.н.,  младший научный сотрудник, лаборатория микробной энзимологии, ИБФМ РАН ФИЦ
ПНЦБИ РАН, Пущино

Иван Васильевич Трубицин, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН – обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино

к.б.н., научный сотрудник, лаборатория микробной энзимологии, ИБФМ РАН ФИЦ ПНЦБИ РАН, Пущино

Александр Викторович Лисов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН – обособленное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Пущино

заместитель директора по научной работе ИБФМ РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН, Пущино. Преподаватель
ФГБОУ ВО ПушГЕНИ, Пущино

Опубликован
2020-02-12
Как цитировать
Трубицина, Л. И., Трубицин, И. В., & Лисов, А. В. (2020). Оптимизация методики получения рекомбинантных двухдоменных лакказ. Сорбционные и хроматографические процессы, 20(1), 109-114. https://doi.org/10.17308/sorpchrom.2020.20/2386