Активность глутатионредуктазы при сахарном диабете 2 типа и каталитические свойства фермента, выделенного с помощью хроматографических методов
Аннотация
Целью настоящей работы явилось определение активности глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2) в сыворотке крови больных с сахарным диабетом 2 типа (СД2) и в сыворотке крови крыс с экспериментальным СД2, а также разработка схемы очистки фермента из печени экспериментальных животных с применением хроматографических методов и исследование его каталитических свойств. В эксперименте использовали сыворотку крови практически здоровых лиц с нормальными показателями общего и биохимического анализов крови (контрольная группа пациентов), людей, которым был поставлен диагноз СД2, а также сыворотку и печень крыс контрольной группы и животных с экспериментальным СД2.
Патологическое состояние у экспериментальных животных моделировали путем комбинации высокожировой диеты в течение 1 месяца и последующего двукратного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина (СТЗ) с интервалом 7 дней в дозе 30 мг/кг веса животного в цитратном буфере рН 4,4. Забой животных производили через 14 дней после введения СТЗ. Активность ГР определяли спектрофотометрически на СФ-56 при 340 нм. Общее количество белка определяли по методу Лоури. Для исследования каталитических свойств фермента была проведена его очистка из печени крыс контрольной группы и животных с индуцированным СД2 с помощью методов разделения белков сульфатом аммония, а также гель-фильтрации через сефадекс G-25 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.
В результате были получены ферментные препараты ГР, очищенные в 56.4 и 46.0 раза из печени крыс контрольной группы, животных с СД2. В ходе исследования было установлено, что в процессе ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой ГР из печени крыс контрольной группы десорбировалась с максимальной ферментативной активностью при концентрации KCl 100 мМ. Для десорбции ГР печени группы крыс с СД2 с колонки наиболее эффективной оказалась концентрация КСl в среде элюции 50 мМ.
С использованием полученных ферментных препаратов выявлено, что кинетика реакции, катализируемой ГР описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. При этом при патологии имеет место снижение сродства фермента как к окисленному глутатиону, так и к НАДФН. В результате оценки влияния рН на интенсивность функционирования ГР было установлено, что данный энзим из гепатоцитов крыс в норме имеет наибольшую активность при значениях рН, лежащих в диапазоне от 7.2 до 7.5. Оптимальное же значение рН соответствовало значению 7.4. Увеличение или снижение концентрации ионов водорода сопровождалось резким падением ферментативной активности. Показано, что для фермента, выделенного из печени крыс с СД2 рН оптимум равен 7.0. Причем изменение концентрации ионов водорода в большую сторону сопровождается менее резким падением активности ГР, по сравнению с нормой.
Скачивания
Литература
Caturano A., D’Angelo M., Mormone A., Russo V., Mollica M.P., Salvatore T., Galiero R., Rinaldi L., Vetrano E., Marfella R., Monda M., Giordano A., Sasso F.C., Oxidative Stress in Type 2 Diabetes: Im-pacts from Pathogenesis to Lifestyle Modi-fications, Current Issues in Molecular Bi-ology, 2023; 45(8): 6651-6666. https://doi.org/10.3390/cimb45080420
Fatima M.T., Bhat A.A., Nisar S., Fakhro K.A., Ammira S., The role of die-tary antioxidants in type 2 diabetes and neurodegenerative disorders: An assess-ment of the benefit profile, Heliyon, 2023; 9(1): e12698.
Alu S.N., Los E.A., Ford G.A., Stone W.L., Oxidative Stress in Type 2 Diabetes: The Case for Future Pediatric Redoxomics Studies, Antioxidants, 2022; 11(7): 1336. https://doi.org/10.3390/antiox11071336
Wright E., Scism-Bacon J.L., Glass L.C., Oxidative stress in type 2 diabetes: The role of fasting and postprandial gly-caemia, International journal of clinical practice, 2006; 60(3): 308-314. https://doi.org/10.1111/j.1368-5031.2006.00825.x
Samoilova Yu.G., Khoroshunova E.A., Matveeva M.V., Kudlay D.A., Spirina L.V., Akbasheva O.E., Yakimova Ya.L., Modulation of oxidative stress as an early symptom of sarcopenia in type 2 diabetes mellitus, Russian Journal of Preventive Medicine, 2024; 27(10): 108‑116. https://doi.org/10.17116/profmed202427101108
Tuell D., Ford G., Los E., Stone W., The Role of Glutathione and Its Precursors in Type 2 Diabetes, Antioxidants, 2024; 13(2): 184. https://doi.org/10.3390/antiox13020184
Shabalala S.C., Johnson, R., Basson A.K., Ziqubu K., Hlengwa N., Mthembu S.X.H., Mabhida S.E., Mazibuko-Mbeje S.E., Hanser S., Cirilli I., Tiano L., Dludla P.V., Detrimental Effects of Lipid Peroxi-dation in Type 2 Diabetes: Exploring the Neutralizing Influence of Antioxidants, An-tioxidants, 2022; 11(10): 2071. https://doi.org/10.3390/antiox11102071
Lutchmansingh F.K., Hsu J.W., Ben-nett F.I., Badaloo A.V., McFarlane-Anderson N., Gordon-Strachan G.M., Wright-Pascoe R.A., Jahoor F., Boyne M.S., Glutathione metabolism in type 2 diabetes and its relationship with micro-vascular complications and glycemia, PLoS ONE, 2018; 13(16): e0198626. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198626
Zhang M., Lv X.Y., Li J., Xu Z.G., Chen L., The characterization of high-fat diet and multiple low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model, Experi-mental diabetes research, 2008; 2008: 1-9. https://doi.org/10.1155/2008/704045
Selemenev V.F., Rudakov O.B., Slavinskaya G.V., Drozdova N.V. Pig-menty pishchevykh proizvodstv (mela-noidy). Moskva, DeLi print, 2008, 246 p. (In Russ.)
Kramarenko V.F. Toksiko-logicheskaya khimiya. Moskva, Ripol Klassik, 1989, 445 p. (In Russ.)
Lowry O.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem, 1951; 193(1): 265-275.
Glants S. Mediko-biologicheskaya statistika. Moskva, Praktika, 1998, 459 p. (In Russ.)
Kurilova L.S., Krutetskaya Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G., Vliyanie okislennogo glutationa i ego farma-kologicheskogo analoga preparata glutoksim na vnutrikletochnuyu kontsen-tratsiyu Sa2+ v makrofagakh, Tsitologiya, 2008; 50(5): 452-461. (In Russ.)
Pai E.F., Schulz G.E., The catalytic mechanism of glutathione reductase as de-rived from x-ray diffraction analyses of re-action intermediates, J Biol Chem, 1983; 258(3): 1752-1757. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)33050-3
Danilova L.I., Romanovskii A.A., Lushchik M.L., Korolenko G.G., Burko I.I., Radyuk D.V., Valuevich V.V., Ekspertnaya otsenka klinicheskikh sluchaev diabetich-eskogo ketoatsidoza, Retsept, 2023; 26(5): 632-640. https://doi.org/10.34883/PI.2023.26.5.017 (In Russ.)
