Применение хроматографических методов для очистки аконитатгидратазы из сердца крыс с патологией и исследование некоторых каталитических свойств фермента

Аннотация

В ходе настоящей работы была проведена оценка ряда каталитических и регуляторных свойств ферментного препарата цитоплазматической фракции аконитатгидратазы (АГ, КФ 4.2.1.3), очищенного с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии из сердца крыс (Rattus norvegicus линии Wistar) с диклофенак-индуцированным повреждением миокарда, получавших дипиколиновую кислоту (ДПК). Были сформированы три экспериментальные группы животных. Крысам контрольной группы с 15 дня эксперимента вводили внутрибрюшинно физиологический раствор на протяжении 7 дней. Вторая группа животных в первый день получала 100 мкл адъюванта Фрейнда, однократно, в левую подошвенную поверхность задней лапы путем подкожной инъекции. Затем с 15 дня животным внутрибрюшинно вводили диклофенак натрия в дозе 10 мг/кг в течение 7 дней. Третья группа животных параллельно с диклофенаком натрия получала внутрижелудочно дипиколиновую кислоту в дозе 10 мг/кг массы тела. Сердце и сыворотку крови забирали через 24 часа после последней инъекции. Маркерные ферменты цитолиза кардиомиоцитов в сыворотке крови анализировали с помощью коммерческих наборов. Уровень окислительной модификации белков определяли по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Активность АГ исследовали спектрофотометрически при 235 нм. Разделение цитоплазматической и митохондриальной фракции осуществляли с помощью дифференциального центрифугирования. С применением методов фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации через сефадексы G-25 и G-150, и ионообменой хроматографии на КМ-целлюлозе проводили очистку фермента из сердца крыс. В ходе работы была получена АГ цитоплазматической фракции из сердца крыс с диклофенак-индуцированным поражением миокарда с 120-кратной степенью очистки, а из сердца крыс, получавших на фоне патологии ДПК – со степенью очистки 122.1 раза. С применением метода двойных обратных координат Лайнуивера-Берка показано, что введение крысам ДПК сопровождалось восстановлением сродства фермента к цитрату и изоцитрату, по сравнению с показателями при патологии. Помимо этого, наблюдалось изменение в направлении контроля таких параметров ферментативной реакции, как температурный и pH-оптимум, а также энергия активации. Для АГ из сердца крыс с патологией, получавших ДПК, наблюдалось более выраженное увеличение активности фермента при внесении в реакционную среду восстановленного глутатиона, по сравнению с показателями у животных, получавших только диклофенак. Выявленные сдвиги свойств АГ могли быть связаны с изменениями структурных и регуляторных особенностей молекулы фермента на фоне снижения под действием ДПК интенсивности свободнорадикального окисления, развивающегося в результате воздействия диклофенака.