Оценка эффективности экстракции мтДНК из лейкотромбоцитарного слоя крови человека
Аннотация
Митохондриальная ДНК (мтДНК) широко используется в различного рода исследованиях, так как изменения в мтДНК (мутации или крупномасштабные делеции) могут вызывать широкий спектр заболеваний, таких как диабет, сердечные дисфункции, различные формы рака и т.д. Выделение и количественная оценка мтДНК часто требуются для изучения вклада мтДНК в развитие патологий. Однако выделение достаточного количества мтДНК по-прежнему остается трудной задачей.
Целью данного исследования была оценка и сравнение трех методов экстракции мтДНК из лейкотромбоцитарного слоя крови человека. В основе всех выбранных нами наборов для выделения ДНК лежит метод сорбционной экстракции, принцип которой заключается в особых свойствах носителей на основе кремния для селективного связывания ДНК. Также оценивалось влияние двух широко используемых типов антикоагулянтов на эффективность экстракции мтДНК.
Посредством систематического сравнения методов выделения мтДНК мы определили процедуру, обеспечивающую наибольший выход мтДНК, которая, как мы показываем, демонстрирует высокую производительность в последующих анализах.
Для экстракции мтДНК были взяты образцы лейкотромбоцитарного слоя крови у 12 добровольцев и использовались три различных протокола выделения (Quick-DNA Miniprep Plus (Zymo Research, США), Plasmid miniPrep (Evrogen, Россия) и набор QIAamp® Blood Mini Kit (QIAGEN, Германия)). Далее проводилась оценка количества ДНК с помощью флуориметрии и количественной полимеразной цепной реакции.
Полученные результаты показали, что из исследуемых методов выделения ДНК, экстрагированная с помощью набора QIAamp® Blood Mini Kit (QIAGEN, Германия), который основан на применении колонок с силикагелевой мембраной, дает оптимальную концентрацию мтДНК. Разницы между количествами мтДНК, выделенными из крови с различными антикоагулянтами обнаружено не было. Наши результаты подчеркивают важность выбора метода изоляции мтДНК, так как этот этап является определяющим для получения высококачественной мтДНК, которая будет пригодна для дальнейших молекулярно-генетических исследований.
Скачивания
Литература
Weissig V., Edeas M. Mitochondrial Med., 2015, Vol. 1, pp. 1-480. DOI: https://10.1007/978-1-4939-2257-4.
Anderson S., Bankier A., Barrell B. et al., Nature, 1981, Vol. 290, pp. 457-465. DOI: https://10.1038/290457a0.
Zeviani M., Antozzi C., Mol. Hum. Reprod., 1997, Vol. 3, pp. 133-148. DOI: https://10.1093/molehr/3.2.133.
Bai R.K., Perng C.L., Hsu C.H., Wong L.J., Ann. N. Y. Acad. Sci., 2004, Vol. 1011, pp. 304-309. DOI: https://10.1007/978-3-662-41088-2_29.
Bornstein B., Area E., Flanigan K.M. et al., Neuromuscul. Disord., 2008, Vol. 18, p. 453. DOI: https://10.1016/j.nmd.2008.04.006.
Chan S.L., Copeland W.C., Biochim. Biophys. Acta, 2009, Vol. 1787, p. 312. DOI: https://10.1016/j.bbabio.2008.10.007.
Marín-García J., Akhmedov A.T., Moe G.W., Heart Fail. Rev., 2013, Vol. 18, pp. 439-456. DOI: https://10.1007/s10741-012-9330-2.
Lan Q., Lim U., Liu C.S. et al., Blood, 2008, Vol. 112, p. 4247. DOI: https://10.1182/blood-2008-05-157974
Xia P., An H.X., Dang C.X. et al., BMC Cancer, 2009, Vol. 9, p. 454. DOI: https://10.1186/1471-2407-9-454.
Timmermans E.C., Tebas P., Ruiter J.P. et. al., Clin. Chem., 2006, Vol. 52, pp. 979-987. DOI: https://10.1373/clinchem.2005.062901.
Lee H.K., Song J.H., Shin C.S. et al., Diabetes Res. Clin. Pract., 1998, Vol. 42, pp. 161-167. DOI: https://10.1016/s0168-8227(98)00110-7.
Weng S.W., Lin T.K., Liou C.W. et al., Diabetes Res. Clin. Pract., 2009, vol. 83, pp. 94-99. DOI: https://10.1016/j.diabres.2008.10.002.
Song J., Oh J.Y., Sung Y.A. et al., Diabetes Care, 2001, Vol. 24, pp. 865-869. DOI: https://10.2337/diacare.24.5.865.
Lee J.E., Park H., Ju Y.S. et. al. Exp. Mol. Med., 2009, Vol. 41, p. 253. DOI: https://10.3858/EMM.2009.41.4.028.
Elliott H.R., Samuels D.C., Eden J.A. et al., Am. J. Hum. Genet., 2008, Vol. 83, pp. 254-260. DOI: https://10.1016/J.AJHG.2008.07.004.
Brandon M.C., Lott M.T., Nguyen K.C., et. al. Nucleic Acids Res., 2005, vol. 33, pp. 611-613. DOI: https://10.1093/NAR/GKI079.
Gahan M.E., Miller F., Lewin S.R. et al., J. Clin. Virol., 2001, Vol. 22, pp. 241-247. DOI: https://10.1016/S1386-6532(01)00195-0.
Chabi B., Mousson de Camaret B., Duborjal H. et al., Clin. Chem., 2003, Vol. 49, pp. 1309-1317. DOI: https://10.1373/49.8.1309.
Meissner C., Mohamed S.A., Klueter H. et al., Forensic Sci. Int., 2000, Vol. 113, pp. 109-112. DOI: https://10.1016/S0379-0738(00)00249-8.
Cady N.C., Stelick S., Batt C.A., Bio-sensors & Bioelectronics, 2003, Vol. 19, No 1, pp. 59-66. DOI: https://10.1016/s0956-5663(03)00123-4.
Rimola A., Costa D., Sodupe M., Lambert J.F. et al., Chemical Reviews, 2013, Vol. 113, No 6, pp. 4216-4313. DOI: https://10.1021/cr3003054.
Zhang Y., Cremer P.S., Current Opinion in Chemical Biology, 2006, Vol. 10, No 6l, pp. 658-663. DOI: https://10.1016/j.cbpa.2006.09.020.
Poeckh T., Lopez S., Fuller A.O., Solomon M.J. et al., Analytical Biochemistry, 2008, Vol. 373, No 2, pp. 253-262. DOI: https://10.1016/j.ab.2007.10.026.
Smith K, Diggle MA, Clarke SC., J Clin Microbiol., 2003, Vol. 41, No 6, pp. 2440-2443. doi: https://10.1128/JCM.41.6.2440-2443.2003.
Claassen S., du Toit E., Kaba M., Moodley C. et al., Journal of microbiologi-cal methods, 2013, Vol. 94, No 2, pp. 103-110. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2013.05.008
