Определение молекулярной массы нативных молекул изоформ γ-гидроксибутиратдегидрогеназы, полученных из проростков кукурузы (Zea mays L.), методом гель-хроматографии
Аннотация
Известно, что при недостатке кислорода нарушается функционирование цикла трикарбоновых кислот, в результате чего происходит активация альтернативного пути – ГАМК-шунта, который обеспечивает поддержание функционирование цикла лимонной кислоты за счёт поставки янтарной кислоты. Ключевым этапом данного обходного пути является реакция, которую катализирует сукцинатсемиальдегиддегидрогеназа (ССАДГ, КФ 1.1.1.16). При недостатке кислорода ССАДГ перестает эффективно функционировать. Это приводит к накоплению полуальдегида янтарной кислоты в матриксе митохондрий, высокий уровень которого неблагоприятно действует на метаболизм растительной клетки. γ-гидроксибутиратдегидрогеназа (ГБДГ, КФ 1.1.1.61) – энзим, относящийся к классу оксидоредуктаз, который превращает γ-гидроксибутират в полуальдегид янтарной кислоты, участвуя в процессе его детоксикации, что имеет важное значение в поддержании метаболизма растений при дефиците кислорода.
На сегодняшний день, к сожалению, данные о биохимических и кинетических особенностях γ–гидроксибутиратдегидрогеназы отсутствуют. В связи с этим в нашей лаборатории был разработан метод очистки ГБДГ из зеленых листьев кукурузы, который позволяет изучить физико-химические свойства данного энзима.
В ходе исследования проводилась пятистадийная очистка γ-гидроксибутиратдегидрогеназы из 7-дневных проростков Zea mays L. Гомогенизированный растительный материал с экстрагированными белками, подвергали двухстадийному фракционированию сульфатом аммония. Каталитическая активность определялась спектрофотометрически при λ=340 нм по количеству восстановленного НАД+. Для удаления солей аммония осуществляли гель-фильтрацию на Sephadex G-25. Разделение белков по заряду осуществляли с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Sephacel. Энзим десорбировали линейным градиетом хлорида натрия (100-300 мМ). Использование гель-хроматографии через Sephadex G-200 позволило определить молекулярную массу очищенных изоформ фермента. Гомогенность ферментных препаратов подтверждена проведенным электрофорезом в полиакриламидном геле с универсальным окрашиванием AgNO3. Принадлежность полученных белковых препаратов к γ–гидроксибутиратдегидрогеназе была определена с помощью тетразолиевого метода.
В результате были получены гомогенные препараты двух изоформ фермента (ГБДГ1 и ГБДГ2). Первая изоформа γ-гидроксибутиратдегидрогеназы очищена в 185.7 раза с выходом 10% и имела удельную активность 343.6 Е/мг белка. Степень очистки второй изоформы составила 209 раз, выход 7.74%. Удельная активность полученного препарата – 386.7 Е/мг белка.
Использование гель-хроматографии на Sephadex G-200 позволило определить молекулярную массу нативных молекул гидроксибутиратдегидрогеназы. Установлено, что в семидневных проростках кукурузы исследуемый фермент представлен в низкомолекулярной и высокомолекулярной формах: для ГБДГ 1 значение Mr составляло ⁓60.3 кДа, в то время как для ГБДГ2 молекулярная масса энзима равнялась 286 кДа.
Скачивания
Литература
Fait A., Fromm H., Walter D., Galili G., Fernie A.R. Highway or byway: the metabolic role of the GABA shunt in plants. Trends in plant science. 2008; 13(1): 14-19. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2007.10.005
Busch K.B., Fromm H. Plant succinic semialdehyde dehydrogenase. Cloning, pu-rification, localization in mitochondria, and regulation by adenine nucleotides. Plant physiology. 1999; 121(2): 589-598. https://doi.org/10.1104/pp.121.2.589
Allan W.L., Peiris C., Bown A.W., Shelp B.J. Gamma-hydroxybutyrate accu-mulates in green tea and soybean sprouts in response to oxygen deficiency. Canadian Journal of Plant Science. 2003; 83(4): 951-953. https://doi.org/10.4141/P03-085
Shelp B.J., Allan W.L., Faure D. Role of g -Aminobutyrate and g -Hydroxybutyrate in Plant Communication. Plant-Environment Interactions. Signaling and Communication in Plants. 2009; 1(1): 73-84. https://doi.org/10.1007/978-3-540-89230-4_4
Fait A., Yellin A., Fromm H. GABA shunt deficiencies and accumulation of re-active oxygen intermediates: insight from Arabidopsis mutants. FEBS letters. 2005; 579(2): 415-420. https://doi.org/10.1016/
j.febslet.2004.12.004
Kaplan F., Kopka J., Sung D.Y., Zhao W., Popp W., Porat R., Guy C.L. Transcript and metabolite profiling during cold accli-mation of Arabidopsis reveals an intricate relationship of cold‐regulated gene expres-sion with modifications in metabolite con-tent. The Plant Journal. 2007; 50(6): 967-981. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03100.x
Coleman S.T., Fang T.K., Rovinsky S.A., Turano F.J., Moye-Rowley W.S. Ex-pression of a glutamate decarboxylase homologue is required for normal oxidative stress tolerance in Saccharomyces cere-visiae. Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(1): 244-250. https://doi.org/10.1074/jbc.M007103200
Taxon E.S., Halbers L.P., Parsons S.M. Kinetics aspects of Gamma-hydroxybutyrate dehydrogenase. Bio-chimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 2020; 1868(5): 140376. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2020.140376
Selemenev V.F., SHkutina I.V., Mironenko N.V., Belanova N.A., Sinyaeva L.A., Belanova A.A., Kolomiec L.N. Ob osobennostyah stroeniya aktivnogo cen-tra i chetvertichnoj struktury inulinaz. Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy. 2023; 23(5): 741-752. https://doi.org/10.17308/sorpchrom.2023.23/11692 (In Russ.)
Determan G. Gel'-hromatografiya: Gel'-fil'traciya. Gel'-pronikayushchaya hro-matografiya. Molekulyarnye sita. Moskva, Mir. 1970. 252 p. (In Russ.)
Tulchin N., Ornstein L., Davis B.J. A microgel system for disc electrophoresis. Analytical biochemistry. 1976; 72(1-2): 485-490. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90558-3
Maurer G. Disk-elektroforez: Teor-iya i praktika elektroforeza v poliak-rilamidnom gele: Per. s nem. Moskva, Mir, 1971. 247 p. (In Russ.)
Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacryla-mide gels. Analytical chemistry. 1996; 68(5): 850-858. https://doi.org/10.1021/ac950914h
Magalhaes J.R., Ju G.C., Rich P.J., Rhodes D. Kinetics of 15NH4+ assimila-tion in Zea mays: preliminary studies with a glutamate dehydrogenase (GDH1) null mutant. Plant Physiology. 1990; 94(2): 647-656. https://doi.org/10.1104/pp.94.2.647
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Lew-is Farr A., Randall R.J. Protein measure-ment with the Folin phenol reagent. Jour-nal of biological chemistry. 1951; 193(1): 265-275. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)52451-6
Lakin G.F. Biometriya. Moskva, Vysshaya shkola, 1990. 351 p. (in Russ.)
