Выделение и идентификация генов сукцинатдегидрогеназы мембранными методами
Аннотация
Важнейшим этапом подготовки биологических образцов для проведения биохимических и/или диагностических процессов является выделение нуклеиновых кислот из образца. Выбор метода выделения РНК зависит прежде всего от поставленных задач, а также от ряда требований, основными из которых являются следующие: экономичность и простота метода, высокий выход выделяемой РНК, а также достаточная степень очистки конечного продукта. Целью данной работы являлась идентификация генов сукцинатдегидрогеназы в клетках печени крыс с использованием силикагельной мембраны для выделения суммарной клеточной РНК. Набор PureLink®RNA MiniKit (Invitrogen, США) позволил получить препарат суммарной РНК практически без следов деградации, что подтверждается содержанием 28S рРНК примерно в три раза превышающим содержание 18S рРНК. Технология PureLink® обеспечила высокий выход РНК. Важным преимуществом данного метода явилось также то, что он не требует экстрагирования токсичными растворителями (фенол/хлороформ), центрифугирования с CsCl или LiCl и осаждения спиртом, т.е. использования веществ, являющихся ингибиторами ПЦР. Кроме того, в связи с малой сменой наконечников и эппендорфов, возможность загрязнения значительно сокращена, что подтверждено спектрофотометрически (соотношение A260/A280 для выделенного препарата РНК составило 2,03, а A260/A230– 1,98, что характеризует его как высокоочищенный). Таким образом, была подобрана эффективная методика выделения суммарной клеточной РНК, не имеющая в своем составе примесей посторонних нуклеиновых кислот. Чистая РНК, полученная в ходе выделения с применением силикагельной мембраны, в дальнейшем применяли для получения комплементарной ДНК. Полученная кДНК, путём применения метода реакции обратной транскрипции, использовалась в дальнейшем для количественной оценки содержания транскриптов генов, кодирующих субъединицы А и В (sdha и sdhb) сукцинатдегидрогеназы. Проведенный в дальнейшем ПЦР-анализ показал, что подобранные нами праймеры являются специфичными и могут быть использованы в дальнейших исследованиях по определению скорости транскрипции генов sdha и sdhb сукцинатдегидрогеназы у крыс в норме и при различных патологиях.
Скачивания
Литература
Harwood A.J., Methods in Molecular Biology, 1994, Vol. 58, pp. 3-7.
Grigor'eva E.A., Nejolova O.V., Sovremennye naukoemkie tehnologii, 2014, No 7-2. p. 85.
Krisilova E.V., Oros G.Yu., Krisilov A.V., Selemenev V.F., Zhurnal fizicheskoj khimii, 2014, Vol. 88, No 4, pp. 692-696.
Moss D., Harbison S.A., Saul D.J., Int. J. LegalMed., 2003, Vol. 117, pp. 340-349.
Buckingham L., Flaws M.L. Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods, &Clinical Applications, F.A. Davis, Phila-delphia, Pa, USA, 2007, 479 p.
Cseke L.J., Kaufman Р.В., Podila G.K., Tsai С.-J. Hand book of Molecular and Cel-lular Methods in Biology and Medicine – CRCPress, BocaRaton, Fla, USA, 2ndedition, 2004, 580 p.
Boom R., Sol C.J., Salimans M.M., Jan-sen C.L. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, Vol. 28, No 3, pp. 495-503.
Eprincev A.T., Popov V.N., Shevchenko M.Yu. Jekspressija i reguljacija fermentov glioksilatnogo cikla, Voronezh, Central'no-Chernozemnoe knizhnoe izd-vo, 2005, 224 p.
Vu T.L., Selivanova N.V., Eprincev A.T., Fedorin D.N., Sorbtsionnye I khroma-tograficheskie protsessy, 2011, Vol. 11, No 6, pp. 900-904.
Eprincev A.T., Fedorin D.N., Selivanova N.V. Molekuljarnye aspekty formirovani-ja oligomernoj struktury sukcinatdegidro-genazy, Voronezh, 2016, 264 p.
Bustin S.A., J MolEndocrinol, 2002, pp. 23-39. doi: 10.1677/jme.0.0290023.
Selemenev V.F. Pigmenty pishchevyh proizvodstv (melanoidiny), M., DeLi print, 2008. 245 p.
Chen Q., Yu H.W., Wang X.R., Xie X.L. et al., Genet. Mol. Res., 2012, Vol. 11, No 2, pp. 1773-1782.doi: 10.4238/2012.
Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J. et al., Science, 1988, Vol. 239, No 4839, pp.487-91
