Выделение изоформ НАД+-зависимой малатдегидрогеназы кукурузы хроматографическими методами
Аннотация
НАД+-малатдегидрогеназа (НАД+-МДГ, КФ 1.1.1.37) является распространенным ферментом, играющим важную роль во многих метоболических процессах, таких как ЦТК, азотный обмен и транспорт НАДН. Различные условия среды сильно влияют на активность ферментов, активируя или ингибируя ее. Целью данной работы было исследование изменения активности малатдегидрогеназ при действии различных температур.
В качестве объекта исследования выступали 10-дневные проростки Zea mays, выращенные гидропонным методом. Изоферменты малатдегидрогеназ из листьев кукурузы были очищены с помощью четырехстадийной очистки, включавшей в себя стадии гомогенизирования растительного материала, осаждения белка сульфатом аммония в концентрации 25-80% насыщения, гель-фильтрации через сефадекс G-25 и ионообменной хроматографии на колонке, заполненной ДЭAЭ-Sephacel. Элюция проводилась линейным градиентом хлористого натрия в концентрации от 0 до 150 мМ, в процессе которой собирались фракции с малатдегидрогеназной активностью. Измерение активности ферментов проводилось спектрофотометрически по определению скорости образования или расходования НАДН при длине волны 340 нм. Электрофоретические исследования проводили в полиакриламидном геле с последующим универсальным окрашиванием белков нитратом серебра или специфическим проявлением ферментативной активности тетразолиевым методом с индукцией образования нерастворимого диформазана в месте расположения фермента.
Препарат цитоплазматической МДГ характеризовался удельной активностью 256 Е/мг белка и степенью очистки 115. Выход составил 3.5 %. Удельная активность митохондриальной формы исследуемого фермента равнялась 155 Е/мг белка при степени очистки 67 и выходе 2%. Пероксисомальная форма МДГ характеризовалась удельной активностью 180 Е/мг белка, степенью очистки 78 и выходом 1%. Было показано незначительное влияние получасовой инкубации фермента при 7, 15, 30оС. Определены температурные оптимумы для прямой и обратной реакций трех форм малатдегидрогеназ: 25 и 45оС для цитоплазматической и 30 и 45оС для митохондриальной. Температурный оптимум пероксисомальной формы для реакций окисления малата и восстановления оксалоацетата одинаков и равняется 35оС.
Скачивания
Литература
Arabceva M.A., Eprincev A.T., Falaleeva M.I., Parfenova I.V., Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Himiya. Biologiya. Farmaciya, 2008, No 1, pp. 69-73.
Yudina R.S., Informacionnyj vestnik VOGiS, 2010, Vol. 14, No 2, pp. 243-254.
Minarik P., Tomaskova N., Kollarova M., Antalik M., General physiology and biophysics, 2002, Vol. 21, No 3, pp. 257-266.
Eprincev A.T., Gataullina M.O., Pri-kladnaya biohimiya i mikrobiologiya, 2018, Vol. 54, No 3, pp. 299-303.
Popov V.N., Volvenkin S.V., Kosmatyh T.A., Suad A. et al., Biohimiya, 2001, Vol. 66, No 5, pp. 617-623.
Ansari S.A., Husain Q., Biotechnology advances, 2012, Vol. 30, No 3, pp. 512-523.
Chang Y.Y., Hung C.H., Hwang T.S., Hsu C.H., Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Com-munications, 2013, Vol. 69, No 11, pp. 1249-1251.
Gataullina M.O., Eprincev A.T., Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy, 2018, Vol. 18, No 1, pp. 111-117.
Selemenev V.F., Rudakova L.V., Rudakov O.B., Belanova N.A. et al., Fosfolipidy na fone prirodnyh matric, Voronezh, Nauchnaya kniga, 2020, 318 p.
Bondareva L.P., Astapov A.V., Sele-menev V.F., Il'ina A.YU., Zhurnal fizicheskoj himii, 2018, Vol. 92, No 8, pp. 1323-1328.
Lowry O.H., J. Biologi., 1951, Vol. 193, pp. 265-275.
Ershova A.N., Fatullaeva A.S., Fundamental'nye issledovaniya, 2014, Vol. 11, No 12, pp. 2345-2349.
Novikov V.YU., Muhin V.A., Rysa-kova K.S., Prikladnaya biohimiya I mikrobiologiya, 2007, Vol. 43, No 2, pp. 178-183.
Radnagurueva A.A., Lavrent'eva E.V., Budagaeva V.G., Barhutova D.D. et al., Mikrobiologiya, 2016, Vol. 85, No 3, pp. 347-360.
Mordkovich N.N., Antipov A.N., Okorokova N.A., Safonova T.N. et al., Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya, 2020, Vol. 56, No 6, pp. 577-586.
Sudachkova N.E., Romanova L.I., Astrahanceva N.V.,Novoselova M.V., Sibirski jlesnoj zhurnal, 2017, No 1, pp. 4-14.
Halilov R.A., Dzhafarova A.M., Hizrieva S.I., Abdullaev V.R., Byulleten' eksperimental'noj biologi i imediciny, 2019, Vol. 168, No 9, pp. 292-296.
SWISS-MODEL. Режим доступа: https://swissmodel.expasy.org/ (дата обращения: 24.05.2021)
