Физико-химические и каталитические свойства изоферментов аконитатгидратазы, полученных с помощью хроматографических методов, из печени крыс
Аннотация
Целью работы было получение с помощью хроматографических методов гомогенных изоферментов аконитатгидратазы (аконитаза, АГ, КФ 4.2.1.3), локализованных в митохондриях и цитоплазме гепатоцитов крыс, и изучение их физико-химических и каталитических свойств. Активность аконитазы определяли спектрофотометрически (при 240 нм). Для получения гомогенных препаратов АГ фермент очищали с использованием хроматографических способов, включающих на несколько этапов (высаливание гомогената сульфатом аммония, обессоливание или гель-фильтрация через сефадекс G-25 и ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Тоуореаrl и гель-хроматография на сефадексе G-200). Чистоту выделенных ферментных препаратов оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Белок в пробах измеряли по Лоури. Величину молекулярной массы АГ определяли методом денатурирующего электрофореза по Лэммли. Универсальное окрашивание белков проводили нитратом серебра. С целью подтверждения соответствия выделенных белков изоферментам аконитатгидратазы параллельно осуществляли специфическое проявление геля тетразолиевым методом с добавлением НАФД-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ) в качестве вспомогательного фермента.
Применение хроматографических методов для очистки АГ из печени крыс Rattus norvegicus линии Wistar позволило получить гомогенные ферментативные препараты аконитатгидратазы с удельной активностью цитозольной формы – 1.736±0.024 Е/мг белка, а митохондриальной– 1.256±0.018 Е/мг белка, которые были использованы для исследования физико-химических и кинетических характеристик. Значения молекулярной массы цитоплазматической АГ из гепатоцитов крыс составили 91±5.2 кДа, а митохондриальной – 81±4.1 кДа. Выявлено, что обе формы аконитазы являются гомодимерами. Величина молекулярной массы (Mr ) субъединиц составляет 45 кДа для цитоплазматической фракции и
41 кДа – для АГ из митохондрий. Показано, что кинетические характеристики ферментативной реакции, которые катализируют цитоплазматический и митохондриальный изоферменты аконитатгидратазы, подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен. Установлено, что аконитаза имеет большее сродство к цис-аконитату, чем к цитрату. Показано, что изофермент из цитоплазмы имел рН оптимум 8.0±0.1, то есть находился в щелочной области по сравнению с АГ из митохондрий (7.4±0.1).
Скачивания
Литература
Ayyar V.S., Sukumaran S., DuBois D.C., Almon R.R., Jusko W.J. Modeling Corticosteroid Pharmacogenomics and Proteomics in Rat Liver. J Pharmacol Exp Ther. 2018; 367(1): 168-183.
Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Cherkasskikh M.V., Igamberdiev A.U. Regula-tion of expression of the mitochondrial and cytosolic forms of aconitase in maize leaves via phytochrome. Plant Physiology and Biochemistry. 2020; 146: 157-162.
Chen X.J., Wang X., Butow R.A. Yeast aconitase binds and provides metabolically coupled protection to mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(34): 13738-13743.
Austin C.M., Wang G., Maier R.J. Aconitase Functions as a Pleiotropic Post-transcriptional Regulator in Helicobacter pylori. J Bacteriol. 2015; 197(19): 3076-3086. https://doi.org/10.1128/JB.00529-15
Seznec H., Simon D., Monassier L., Criqui-Filipe P., Gansmuller A., Rustin P., Koenig M., Puccio H. Idebenone delays the onset of cardiac functional alteration without correction of Fe-S enzymes deficit in a mouse model for Friedreich ataxia. Hum Mol Genet. 2004; 13: 1017-1024.
Anderson C.P., Shen M., Eisenstein R.S., Leibold E.A. Mammalian iron me-tabolism and its control by iron regulatory proteins. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9): 1468-1483.
Mashruwala A.A., Boyd J.M. The Staphylococcus aureus SrrAB Regulatory System Modulates Hydrogen Peroxide Resistance Factors, Which Imparts Protection to Aconitase during Aerobic Growth. PLoS One. 2017; 12(1): e0170283. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170283
Gardner P.R. Aconitase: sensitive target and measure of superoxide. Methods Enzymol. 2002; 349: 9-23.
Kosanović M., Milutinović B., Goč S., Mitić N., Janković M. Ion-exchange chromatography purification of extracellular vesicles. Biotechniques. 2017; 63(2): 65-71. https://doi.org/10.2144/000114575
Eprincev A.T., Popov V.N., Shevchenko M.Yu. Glioksilatnyj cikl: universal'nyj mekhanizm adaptacii? M. Akademkniga. 2007. 228 p. (In Russ.)
Mæhre H.K., Dalheim L., Edvinsen G.K., Elvevoll E.O., Jensen I.-J. Protein Determination-Method Matters. Foods. 2018; 7(1): 5. https://doi.org/10.3390/foods7010005
Chakavarti B., Chakavarti D. Elec-trophoretic separation of proteins. J Vis Exp. 2008; 16: 758. https://doi.org/10.3791/758
Pollock N.L., Rai M., Simond K.S., Hesketh S.J., Teo A.C.K., Parmar M., Sri-dhar P., Collins R., Lee S.C., Stroud Z.N., Bakker S.E., Muench S.P., Barton C.H., Hurlbut G., Roper D.I., Smith C.J.I., Knowles T.J., Spickett C.M., East J., Postis M., Dafforn T. R. SMA-PAGE: A new method to examine complexes of membrane proteins using SMALP nano-encapsulation and native gel electrophoresis. Biochim Bi-ophys Acta Biomembr. 2019; 1861(8): 1437-1445.
Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 1996; 68: 850-858. https://doi.org/10.1021/ac950914h
Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Ni-kitina M.V., Igamberdiev A.U. Expression and properties of the mitochondrial and cytosolic forms of aconitase in maize scutellum. Journal of Plant Physiology. 2015; 181: 14-19.
Semenova E.V., Eprincev A.T., Po-pov V.N. Indukciya akonitatgidratazy v gepatocitah golodayushchih krys. Biohimi-ya. 2002; 67(7): 959-966. (In Russ.)
Selivanova N.V., Moiseenko A.V., Bakarev M.YU., Eprincev A.T. Ispol'zovanie ionoobmennoj hromatografii na DEAE-cellyuloze dlya razdeleniya izofermentov malatdegidrogenazy iz gepatocitov krys v norme i pri alloksanovom di-abete. Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy. 2021; 21(4): 568-576. https://doi.org/10.17308/sorpchrom.2021.21/3641 (In Russ.)
Preble J.M., Pacak Ch.A., Kondo H., MacKay A.A., Cowan D.B., McCully J.D. Rapid isolation and purification of mi-tochondria for transplantation by tissue dis-sociation and differential filtration. J Vis Exp. 2014; 91: 51682. https://doi.org/10.3791/51682
Selemenev V.F., Khohlov V.YU., Bobreshova O.V., Aristov I.V. et al. Fiziko-himicheskie osnovy sorbcionnyh i membrannyh metodov vydeleniya i razdeleniya aminokislot. M. Stelajt. 2002. 299 p. (In Russ.)
Sriram G., Martinez J.A., McCabe E.R., Liao J.C., Dipple K.M. Single-gene disorders: what role could moonlighting enzymes play? Am J Hum Genet. 2005; 76(6): 911-924.
Nakano Sh., Fukaya M., Horinouchi S. Enhanced expression of aconitase raises acetic acid resistance in Acetobacter aceti. FEMS Microbiol Lett. 2004; 235(2): 315-322. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2004.05.007
Flint D.H., Allen, R.M. Ironminus signSulfur Proteins with Nonredox Functions. Chem. Rev. 1996; 96: 2315-2334.
Gruer M.J., Artymiuk P.J., Guest J.R. The aconitase family: three structural variations on a common theme. Trends Biochem. Sci. 1997; 22: 3-6. https://doi.org/10.1016/s0968-0004(96)10069-4
Gawron O.S., Kennedy M.C., Rauner R.A. Properties of pig heart aconitase. Biochem. J. 1974; 143(3): 717-722.
Kennedy M.C., Kent T.A., Emptage M., Merkle H., Beinert H., MünckE. Evidence for the formation of a linear [3Fe-4S] cluster in partially unfolded aconitase. J Biol Chem. 1984; 259(23): 4463-14471.
Uhrigshardt H., Walden M., John H., Anemüller S. Purification and charac-terization of the first archaeal aconitase from the thermoacidophilic Sulfolobus acidocaldarius. Eur J Biochem. 2001; 268(6): 1760-1771.
Schloss J.V., Emptage M.H., Cle-land W.W. pH profiles and isotope effects for aconitases from Saccharomycopsis lipo-lytica, beef heart, and beef liver. alpha-Methyl-cis-aconitate and threo-Ds-alpha-methylisocitrate as substrates. Biochemistry. 1984; 23(20): 4572-4580. https://doi.org/10.1021/bi00315a010
