Применение ионообменной хроматографии для очистки глутатионредуктазы из печени крыс с парацетамол-индуцированным поражением печени для исследования некоторых каталитических свойств
Аннотация
Целью работы явилось исследование активности глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.8.1.7.) при парацетамол-индуцированном поражении печени (ППП), а также выделение и очистка фермента с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии для оценки некоторых каталитических и регуляторных свойств. ППП моделировали путем однократного перорального введения ацетаминофена самцам белых лабораторных крыс (Rattus norvegicus) Wistar в дозе 1000 мг/кг массы тела, растворенного в 1 см3 вазелинового масла. Животные контрольной группы получали вазелиновое масло. Активность ГР определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Очистку фермента из печени крыс осуществляли с помощью фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации через сефадекс G-25, а также ионообменой хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Общее количество белка в пробах определяли при помощи набора BCA protein assay kit. В ходе работы была получена ГР из печени крыс с ППП со степенью очистки 33.3. С использованием метода двойных обратных координат Лайнуивера-Берка показано, что введение крысам парацетамола сопровождалось увеличением сродства фермента к НАДФН. Добавление в реакционную среду изоцитрата и глюкозо-6-фосфата, являющихся субстратами ферментов-поставщиков НАДФН для восстановления окисленного глутатиона, способствовало более выраженной активации ГР из печени животных с ППП по сравнению с контрольной группой. Наблюдаемое возрастание активности ГР при добавлении изоцитрата и глюкозо-6-фосфата было, по-видимому, связано с дополнительным активирующим действием данных соединений на фермент, реализующимся в условиях окисления восстановленного глутатиона при ППП. В то же время, введение в среду спектрофотометрирования цитрата приводило к более существенному снижению активности ГР относительно контрольных показателей. Наблюдаемые изменения свойств фермента могли быть связаны с наличием у цитрата антиоксидантных свойств, снижающих интенсивность свободнорадикального окисления при ППП. Таким образом, путём фракционирования, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе был получен очищенный препарат ГР из печени крыс с ППП, для которого продемонстрировано увеличение сродства к НАДФН и изменение регуляции активности под действием цитрата, изоцитрата и глюкозо-6-фосфата.
Скачивания
Литература
Korenskaya E.G., Paramonova O.V. Medicinal liver damage is one of the important problems in a comorbid patient. Consilium Medicum. 2019; 21(8): 78-83. https://doi.org/10.26442/20751753.2019.8.190355
Kong L.Z., Chandimali N, Han Y.H., Lee D.H., Kim J.S., Kim S.U., Kim T.D., Jeong D.K., Sun H.N., Lee D.S., Kwon T. Pathogenesis, Early Diagnosis, and Therapeutic Management of Alcoholic Liver Disease. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20(11): 2712-2733. https://doi.org/10.3390/ijms20112712
Cichoż-Lach H., Michalak A. Oxida-tive stress as a crucial factor in liver diseases. World J Gastroenterol. 2014; 20(25): 8082-8091. https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i25.8082
Newsome P.N., Plevris J.N., Nelson L.J., Hayes P.C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation Liver Transpl. 2000; 6: 21-31. https://doi.org/10.1002/lt.500060110
Polson J., Lee W.M., American Asso-ciation for the Study of Liver Disease. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 2015: 41(5): 1179-1197. https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i25.8082
Wang Z., Hao W., Hu J. Maltol improves APAPinduced hepatotoxicity by inhibit-ing oxidative stress and inflammation response via NF-κB and PI3K/Akt signal pathways. Antioxidants. 2019; 8(9): 395-398. https://doi.org/10.3390/antiox8090395
Hasanuzzaman M., Bhuyan, M.H.M.B., Anee, T.I., Parvin, K., Nahar, K., Mahmud, J.A., Fujita, M. Regulation of Ascorbate-Glutathione Pathway in Mitigating Oxidative Damage in Plants under Abiotic Stress. Antioxidants. 2019; 8: 384. https://doi.org/10.3390/antiox8090384
Mitchel J.R., Jallow D.G., Potter W.Z., Acetaminopheninduced hepatic necrosisss. Protective role of glutathione. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 187: 211-217. https://doi.org/10.3390/antiox8090395
Popov S.S., Agarkov A.A., Kryl'skiy E.D., Shul'gin K.K., Popova T.N., Safonova O.A. The activity of glutathione reductase un-der liver pathologies and enzyme purification by ion-exchange chromatography for the catalytic properties study. Sorbtsionnye I Khromatograficheskie Protsessy. 2018; 7(1): 168-175.
Jönsson B.A.G., Ermund A., Andersson D.A, Björk H, Alexander J.P. Conversion of acetaminophen to the bioactive N-acylphenolamine AM404 via fatty acid amide hydrolase-dependent arachidonic acid conjugation in the nervous system. J Biol Chem. 2015; 280: 31405-31412. https://doi.org/10.1074/jbc.M501489200
Graham G.G., Davies M.J., Day R.O., Mohamudally A., Scott K.F. The modern pharmacology of paracetamol: therapeutic ac-tions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. In-flammopharmacology. 2013; 21: 201-232. https://doi.org/10.1007/s10787-013-0172-x
Tran R.T., Yang J., Ameer G.A. Citrate-Based Biomaterials and Their Applications in Regenerative Engineering. An-nu Rev Mater Res. 2015; 45: 277-310. https://doi.org/10.1146/annurev-matsci-070214-020815
Akram M. Citric Acid Cycle and Role of its Intermediates in Metabolism. Cell Biochem Biophys. 2014; 68: 475-478. https://doi.org/10.1007/s12013-013-9750-1
