Об особенностях строения активного центра и четвертичной структуры инулиназ

Аннотация

В настоящее время многие исследователи стали обращать внимание на то, что не только традиционные сорбенты и ионообменники, но и ряд природных компонентов, содержащихся в растительных и животных организмах, обладают способностью поглощать другие органические молекулы и ионы, вступать в реакции комплексообразования с ионами металлов, проявлять каталитические свойства. К таким природным веществам, обладающим сорбционными и ионообменными свойствами, можно отнести аминополисахариды (хитин, хитозан), нуклеиновые и рибонуклеиновые кислоты, сапонины, ферменты. Приведенный перечень веществ можно отнести к высокомолекулярным соединениям, обладающим сорбционными, лигандными и каталитическими свойствами. В настоящей работе приводятся результаты исследования функциональных групп активного центра инулиназы и особенностей ее четвертичной структуры. Установлено, что фермент имеет четвертичную структуру, представленную двумя субъединицами с Mr 76900 Да и 10140 Да, обладающими каталитической активностью. В образовании фермент-субстратного комплекса принимают участие имидазольный радикал гистидина, SH-группы и карбоксильные группы. Целью данной работы явилось изучение функциональных групп активного центра и некоторых особенностей четвертичной структуры инулиназы.

В настоящей работе использован препарат инулиназы, выделенной из Aspergillus awamori Ц2250, очищенный методом ионообменной хроматографии на колонках с диэтиламиноэтилцеллюлозой (ДЭАЭ): [-O-(CH₂)₂-N(C₂H₅)₂]. Гомогенность препарата была подтверждена методом гель-электрофореза. Каталитическая активность инулиназы определялась на субстрате инулине (Spofa, Чехия) спектрофотометрически с помощью резорцина при λ=540 нм, а молекулярная масса – методом гель-хроматографии на Сефадексе G-200. Наличие электрофильных групп СОО- устанавливали по методу Диксона, а также методом ИК-спектроскопии на приборе Vertex-70 в интервале частот 4000-400 см^-1.

В состав активного центра фермента входят γ и δ-карбоксильные группы остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот соответственно. Ион водорода Н⁺ отщепляется от карбоксильной группы глутаминового остатка фермента и связывается с кислородом, соединяющим кольца А и Б субстрата. В результате связь кислорода с кольцом разрывается, а углерод, находящийся в положении I кольца А, образует карбониевый ион, который стабилизируется СОО^--группой аспарагинокислого остатка фермента. С карбониевым ионом взаимодействует ОН^--ион, доставляемый молекулой воды, а Н⁺-ион воды фиксируется на место Н⁺-иона, потерянного глутаминокислым остатком в инулиназе. После этого молекулы инулина покидают фермент, освобождая его для последующей реакции с субстратом. Однако данный механизм не является единственным. В образовании фермент-субстратного комплекса также принимает участие имидазол гистидина. При взаимодействии с инулином имидазольная группа связывается водородной связью с кислородом, соединяющим кольца А и Б субстрата. Происходит также ориентация СОО^- иона фермента относительно образующегося карбониевого иона в кольце А. В последующем ионы Н⁺ и ОН^- из молекул воды фиксируются в инулиназе на место Н⁺, потерянного Glu, а ОН^- на карбониевом ионе инулина.