Выделение и очистка изоцитратлиазы хроматографическими методами из печени крыс в условиях аллоксан-индуцированного диабета

Аннотация

С использованием хроматографических методов был получен гомогенный препарат, обладающий изоцитратлиазной активностью из пероксисомальной фракции гепатоцитов крыс. В качестве объекта исследования использовались самцы лабораторных крыс (Rattus norvegicus) линии Вистар. Экспериментальный диабет индуцировали однократной инъекцией 5% раствора аллоксана. Контроль за развитием диабета осуществляли по измерению уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра (СателлитПлюс ПКГ-02.4). Забор крови осуществлялся в утренние часы из хвостовой вены. На 10 день эксперимента лабораторные животные были подвержены декапитации, предварительно усыпленные эфирным наркозом, для получения образцов печеночной ткани. Для выделения гомогенного препарата изоцитратлиазы (ИЦЛ, КФ 4.1.3.1.) были использованы хроматографические методы. Очистка включала несколько стадий: фракционирование гомогената сульфатом аммония, гель-фильтрацию на колонках, заполненных сефадексом G-25 и ионообменную хроматографию, являющуюся определяющей стадией. В качестве сорбента использовался анионообменник ДЭАЭ-Sephacel. Это позволило достичь степень очистки для первой изоформы ИЦЛ 12.12 и 24.24 – для второй. Удельная активность для первого препарата составила 0.04 Е/мг белка, а выход – 26.3%. Значение удельной активности для второй формы ИЦЛ было 0.08 Е/мг белка, а выход – 47.4%. Для элюции с колонки, заполненной ДЭАЭ-Sephacel использовался ступенчатый градиент градиент КCl (60 мМ – 200 мМ). Идентификацию полученных препаратов осуществляли спектрофотометрически, за счет увеличения оптической плотности, по методу Корнберга (λ-324 нм). Наличие изоформ определяли путем специфического окрашивания геля после электрофореза в ПААГ. В результате четырехстадийной очистки было получено две изоформы с отличной от ИЦЛ (КФ 4.1.3.1) из других источников электрофоретической подвижностью.