Разработка эффективного метода очистки ДНК при бисульфитной конверсии с использованием оксида кремния в качестве сорбента

Аннотация

Метилирование ДНК – один из самых изученных механизмов эпигенетической регуляции генома, который контролирует экспрессию генов растений и животных. Разработка эффективных методов анализа метильного статуса генов имеет огромное значение, так как обработка ДНК бисульфитом натрия – многоэтапный и трудоемкий процесс, в котором недопустимы большие потери целевого продукта. Именно поэтому чистота модифицированной ДНК играет решающую роль в последующем процессе амплификации. Наличие в исследуемых образцах высоких концентраций различных солей и примесей способно ингибировать полимеразную активность ДНК-полимеразы. В типичных протоколах, описывающих методику конверсии ДНК бисульфитом натрия, для очистки модифицированной ДНК используют коммерческие наборы, однако их применение нередко приводит к большим потерям целевого продукта, что существенно снижает эффективность процесса очистки. Кроме того, в условиях большого объема анализируемых образцов применение коммерческих наборов существенно повышает стоимость работ. В рамках исследования разработан эффективный, простой и недорогой способ очистки модифицированной ДНК от солей путём сорбции на диоксид кремния (SiO₂). Применение в качестве сорбента мелкодисперсного диоксида кремния обусловлено его способностью селективно связываться c молекулами отрицательно заряженной ДНК. Анализ конвертированной и очищенной ДНК методом электрофореза в 2% агарозном геле позволил установить, что потери целевого продукта в ходе многостадийной обработки бисульфитом натрия составили порядка 33%. Проведение метил-специфичной ПЦР с использованием праймеров к отдельным CpG-динуклеотидам в составе промотора гена GDH2 глутаматдегидрогеназы кукурузы (Zea mays L.) отмечено, что полученные ампликоны соответствовали теоретическому размеру – 175 п.н., 203 п.н. и 275 п.н. к первому, второму и третьему анализируемому CpG-динуклеотиду, соответственно. В связи с этим, можно утверждать, что конвертированная и сорбированная на диоксид кремния матрица пригодна для анализа метильного статуса ДНК.