Метод конверсии ДНК бисульфитом натрия с сорбцией на оксид кремния
Аннотация
В настоящее время исследования метилирования ДНК представляют значительный интерес в фундаментальных и прикладных направлениях, позволяющих раскрыть неизвестные аспекты контроля за пролиферацией и дифференцировкой клеток (в том числе и аномальной), механизмы адаптации, а также разработать способы регуляции работы генома без изменения нуклеотидной последовательности, в том числе и для создания методов лечения различных опухолей, и других аномалий, связанных с нарушением паттерна экспрессии некоторых генов. Цель работы – разработка и оптимизация метода конверсии ДНК бисульфитом натрия для дальнейшего исследования метилирования ДНК в клетках эукариот. Представленный в данной работе метод основан на модификации ДНК за счет дезаминирования неметилированного цитозина с помощью бисульфита натрия. Методика включает четыре ключевых этапа: денатурация ДНК с использованием щелочи, модификация ДНК путем инкубации с раствором бисульфита натрия при повышенных температурах, очистка ДНК, десульфонирование. Очистка ДНК – критический этап, осуществлялся путем сорбции модифицированной ДНК на диоксид кремния. Проведение стадии твёрдофазной экстракции позволило получить модифицированную ДНК без примесей солей бисульфита, что подтверждалось результатами электрофореза в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Описанный протокол позволяет проводить эффективную модификацию ДНК, полученную из различных тканей, со степенью конверсии ДНК 96-98% с незначительными потерями целевого продукта (33-41%) во время модификации. Данный метод оптимизирует процесс бисульфитной конверсии, предоставляя надежный и экономичный инструмент для анализа паттернов метилирования, с потенциалом к улучшению нашего понимания регуляции экспрессии генов, биологии канцерогенеза и облегчения получения организмов с заданными свойствами.
Скачивания
Литература
Semenova E.V., Varfolomeeva E.Ju., Filatov M.V. Citologija, 2020; 62(2):79-97.
Semenova E.V., Filatov M.V. Citologija, 2013; 55(5): 290.
Battich N., Stoeger T., Pelkmans L. Cell, 2015; 163: 1596.
Stoeger T., Battich N., Pelkmans L. Cell, 2016; 164: 1151.
Panzeri I., Pospisilik J.A. Molecular me-tabolism, 2018; 14: 26.
Krueger F., Kreck B., Franke A. Nature methods, 2012; 9: 145-151. https://doi.org/10.1038/nmeth.1828
Amedeo P., Habu Y., Afsar K., Scheid O.M., Paszkowski J. Nature, 2000; 405: 203-206.
Leichter S.M., Du J., Zhong X. Springer International Publishin, 2022; 1389: 137-157. https://doi.org/10.1007/978-3-031-11454-0_6
Bird A.P., Nucleic Acids Res, 1980; 8: 1499-1504.
Coulondre C., Miller J.H., Farabaugh, P.J., Gilbert, W., Nature, 1978; 274: 775-780.
Ashapkin V.V., Kutueva L.I., Interna-tional Journal of Molecular Sciences, 2020; 21: 7457.
Bird A.P., Wolffe A.P. Cell, 1999; 99: 451-454.
Colot V., Rossignol J. L., Bioessays, 1999; 21: 402-411.
Hafiz I.A., Anjum M.A., Grewal A.G., Chaudhary G.A. Acta physiologiae plantarum, 2001; 23: 491-499.
Du J., Johnson L. M., Groth M., Feng S., Hale C. J., Li S., Jacobsen S. E. Molecular cell, 2014; 55: 495-504.
Du J., Johnson L.M., Jacobsen S.E., Pa-tel D.J. Nature reviews Molecular cell biology, 2015; 16: 519-532. https://doi.org/10.1038/nrm4043
Papareddy R. K., Paldi K., Smolka A. D., Hüther P., Becker C., Nodine M. D. elife, 2021; 10: 69396.
Lindroth A.M., Cao X., Jackson J.P., Zilberman D., McCallum C.M., Henikoff S. Science, 2001; 292: 2077-2080. https://doi.org/10.1126/science.1059745
Zhong X., Hale C.J., Nguyen M., Ausin I., Groth M., Hetzel J. Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences, 2015; 112: 911-916. https://doi.org/10.1073/pnas.1423603112
Eprincev A.T., Fedorin D.N., Anohina G.B., Gataullina M.O., Fiziologija rastenij, 2021; 68(2): 187-193. (In Russ.)
Eprintsev A.T., Anokhina G.B., Shakhov Z.N., Moskvina P.P., Igamberdiev, A.U. Inter-national Journal of Molecular Sciences, 2024; 25: 12711.
Eprintsev A.T., Anokhina, G.B., Se-livanova, P.S., Moskvina, P.P., Igamberdiev, A.U. Plants, 2024; 13: 2651.
Frommer M., McDonald L.E., Millar D. S., Collis C.M., Watt F., Grigg G.W., Paul C.L. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992; 89: 1827-1831.
Susan J. C., Harrison J., Paul C. L., Frommer, M. Nucleic acids research, 1994; 22: 2990-2997.
Qiu G. H., Salto-Tellez M., Ross J.A., Yeo W., Cui Y., Wheelhouse N., Hooi, S. C. Journal of hepatology, 2008; 48: 433-441.
Smirnihina S.A., Lavrov A.V., Moleku-ljarnaja biologija, 2009; 43(3): 387-391. (In Russ.)
Jackson J.P., Lindroth A.M., Cao X., Jacobsen S.E. Nature, 2002; 416: 556-560. https://doi.org/10.1038/nature731
Darst R. P., Pardo C. E., Ai L., Brown K. D., Kladde M. P. Current protocols in mo-lecular biology, 2010; 91: 7-9.
Anokhina, G.B., Selivanov, A.Y., Grya-zev, A.S., Eprintsev, A.T., Chukhlebova, O.E. Sorbtsionnye I Khromatograficheskie Protsessy, 2023; 23(2), 290-298. https://doi.org/10.17308/sorpchrom.2023.23/11152
Selemenev V.F., Rudakova L.V., Ruda-kov O.B., Belanova N.A., Nazarova A.A. Fosfolipidy na fone prirodnyh matric. Voro-nezh, Nauchnaja kniga, 2020, 318 p. (In Russ.)
Selemenev V. F., Rudakov O. B., Slav-inskaja G.V., Drozdova N.V. Pigmenty pish-hevyh proizvodstv (Melanoidiny). Moskva, DeLi print, 2008, 246 p. (In Russ.)
