Использование диоксида кремния в качестве сорбента для очистки ДНК из ткани печени крыс при бисульфитной конвер-сии
Аннотация
Эпигенетика – одно из наиболее прогрессивных направлений в современной молекулярной биологии. Одним из механизмов эпигенетической регуляции активности генов является процесс метилирования ДНК. Для определения метильного статуса гена чаще всего прибегают к анализу метилирования ДНК с помощью химической модификации цитозиновых оснований, с последующей детекцией с применением метил-специфической ПЦР. Учитывая, что бисульфит натрия является сильным ингибитором многих ферментов, в том числе ДНК-полимеразы, то при недостаточной очистке препарата ДНК, дальнейшая амплификации и детекция становится невозможным. В исследовании был применен модифицированный метода очистки ДНК от бисульфита натрия с помощью спин-колонок с диоксидом кремния (SiO2) в качестве сорбента. Объектом исследования служили самцы лабораторных крыс (Rattus norwegicus L. линии Wistar). Электрофорез в 1% агарозном геле позволил установить, что очистка ДНК от бисульфита с помощью спин-колонок с силикагелем показала более эффективный результат по сравнению с обработкой ДНК смесью спирт-глицерин. В результате количественной оценки ДНК до и после бисульфитной обработки было показано, что выход ДНК после обработки с очисткой с помощью спин-колонок составил 0.95 мкг/мкл (концентрация ДНК до обработки – 1.19 мкг/мкл), а потери составили около 20%. Тогда как количество ДНК после обработки в случае очистки от бисульфита с помощью инкубации ДНК в смеси этанол-гликоген было 0.14 мкг/мкл (потери порядка 88%). В результате исследования при помощи горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле и дальнейшей визуализации были получены ПЦР-продукты следующих размеров: 518, 180, 140 п.н., потери целевого продукта в ходе модификации ДНК бисульфитом натрия и последующей очистки составили около 20%. Полученные в ходе метил-специфичной ПЦР продукты соответствовали теоретически рассчитанному размеру. Показано, что данный модифицированный метод очистки ДНК от бисульфита натрия пригоден для анализа метильного статуса промотора гена pdhb пируватдегидрогеназы при работе с животными тканями, в частности, с тканями печени лабораторных крыс.
Скачивания
Литература
Patkin E.L., Kvinn Dzh. E`pigeneticheskie mexanizmy` pre-draspolozhennosti k kompleksny`m patologiyam cheloveka. E`kol. genetika, 2010; 8(4): 44-56. (In Russ.)
Mehler M.F. Epigenetic principles and mechanisms underlying nervous sys-tem functions in health and disease. Progr. Neurobiol, 2008; 86: 305-341.
Darst R.P., Pardo C.E., Ai L., Brown K.D., Kladde M.P. Bisulfite se-quencing of DNA, Curr Protoc Mol Biol., 2010; 91(1): 7.9.1.-7.9.17. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb0709s91
Fernandes Sara B., Grova Nathalie, Roth Sarah, Duca Radu Corneliu, Godderis Lode, Guebels Pauline, Mériaux Sophie B., Lumley Andrew I., Bouillaud-Kremarik Pascaline, Ernens Isabelle, Devaux Yvan, Schroeder Henri, Turner Jonathan D. N6-Methyladenine in Eukaryotic DNA: Tissue Distribution, Early Embryo Development, and Neuronal Toxicity, Front. Genet., 2021; 12: 657171. https://doi.org/10.3389/fgene.2021.657171
Ramalho-Carvalho J., Henrique R., Jerónimo C. Methylation-Specific PCR, Methods Mol Biol., 2018; 1708: 447-472. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7481-8_23
Rimola A., Costa D., Sodupe M., Lambert J-F., Ugliengo P. Silica Surface Features and Their Role in the Adsorption of Biomolecules: Computational Modeling and Experiments, Chem. Revs., 2013; 113(6): 4216-4313. https://doi.org/10.1021/cr3003054
Anokhina G.B., Selivanov A.Yu., Gryazev A.S., Eprintsev A.T., Chukhlebova O.E. Razrabotka effektivnogo metoda ochistki DNK pri bisul'fitnoi konversii s ispol'zovaniem oksida kremniya v kachestve sorbenta, Sorbtsionnye i khroma-tograficheskie protsessy, 2023; 23(2): 290-298. https://doi.org/10.17308/sorpchrom.2023.23/11152
Koptyaeva K.E., Muzhikyan A.A., Gushchin Ya.A., Belyaeva E.V., Makarova M.N., Makarov V.G. Metodika vskrytiya i izvlecheniya organov laboratornykh zhivotnykh (krysy), Laboratornye zhivotnye dlya nauchnykh issledovanii, 2018; (2). https://doi.org/10.29296/2618723X-2018-02-08
Rae Peter M.M., Barnett T.R., Bab-bitt D.G. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosoph-ila virilis and Drosophila melanogaster adults and embryos, Biochimica et Bio-physica Acta, 1976; 432(2): 154-160. https://doi.org/10.1016/0005-2787(76)90157-X
Moss D., Harbison S.A., Saul D.J. An easily automated, closed-tube forensic DNA extraction procedure using a thermo-stable proteinase, Int. J. Legal Med., 2003; 117(6): 340-349. https://doi.org/10.1007/s00414-003-0400-9
Wang R.Y.H., Gehrke C.W., Ehr-lich M. Comparison of bisulfite modifica-tion of 5-methyldeoxycytidine and deox-ycytidine residues. Nucleic Acids Res, 1980; 8(20): 4777-4790. https://doi.org/10.1093/nar/8.20.4777
Pajares M.J., Palanca-Ballester C., Urtasun R., Alemany-Cosme E., Lahoz A., Sandoval J. Methods for analysis of specif-ic DNA methylation status. Methods. Else-vier Inc., 2020; 187:3-12. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2020.06.021