Использование препарата малатдегидрогеназы, полученного хроматографическим способом, для специфического проявления фумаратгидратазы из гепатоцитов крыс

Аннотация

Целью данной работы явилось получение хроматографическими методами высокоочищенного препарата малатдегидрогеназы (МДГ) для последующего специфического окрашивания фумаратгидратазы (фумараза, ФГ) из печени здоровых крыс и животных с аллоксановым диабетом. Первым этапом исследования было проведение многоступенчатой схемы очистки МДГ с использованием ионообменной хроматографии в качестве заключительного этапа, в результате которой было получено два ферментных препарата, из которых был выбран образец, проявлявший наибольшую активность
(с выходом 20% и удельной активностью 32.5 Е/мг белка). Активность МДГ измеряли спектрофотометрически при длине волны 340 нм, концентрацию белка определяли методом Лоури. Индукцию экспериментального сахарного диабета 1 типа осуществляли однократной внутрибрюшинной инъекцией 5% раствора моногидрата аллоксана в 0.9% растворе цитрата натрия самцам белых инбредных лабораторных крыс (Rattus norvegicus L) линии Вистар. Животные содержались в виварии с постоянным доступом к корму и воде. Условия эксперимента соответствовали требованиям международных правил гуманного отношения к животным, отражённых в санитарных правилах по отбору и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Все крысы произвольным образом были разделены на 2 группы (Норма и Диабет), по 5 крыс в каждой.

Фумаратгидратаза относится к классу лиаз и не является окислительным ферментом, следовательно, не может быть специфически проявлена в полиакриламидном геле тетразолиевым методом. Однако данную методику специфического окрашивания можно использовать и для ФГ при добавлении в среду проявления малатдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Электрофорез в полиакриламидном геле осуществляли в неденатурирующих условиях в Трис-глициновом буфере. Проведенные электрофоретические исследования с последующим окрашиванием геля тетразолиевым методом показали, что в печени и здоровых крыс, и животных с патологией фумаратгидратаза присутствует в виде двух форм с R_f 0.12 и 0.2, соответственно. Анализ субклеточной локализации ФГ показал, что выявленные формы фермента функционируют в цитоплазме и митохондриях печени крыс обеих групп. Таким образом, использование в качестве основного этапа ионообменной хроматографии позволило получить высокоочищенный препарат малатдегидрогеназы, который в дальнейшем использовался в качестве вспомогательного фермента при специфическом окрашивании фумаратгидратазы из печени крыс с аллоксановым диабетом. Полученные результаты свидетельствуют, что развитие сахарного диабета 1 типа, в отличие от некоторых типов онкологий не связано с блокированием одной из форм ФГ.