Выделение внеклеточных везикул из листьев кукурузы дифференциальным ультрацентрифугированием и идентификация в них микроРНК miR165a
Аннотация
МикроРНК представляют собой класс некодирующих молекул РНК, как важнейших регуляторов различных биологических процессов в растениях. МикроРНК играют важнейшую регуляторную роль ранней ответной реакции клетки на стрессовое воздействие, в том числе и обеспечивая межклеточную сигнализацию. Внеклеточные везикулы растений играют ключевую роль в транспорте молекул в растениях. За последнее десятилетие были разработаны многочисленные методы выделения внеклеточных везикул, при этом дифференциальное центрифугирование позволяет выделять небольших маленькие везикулы. Применение метода дифференциального центрифугирования позволило выделить из листьев кукурузы две фракции внеклеточных везикул (Р40 и Р100), различающихся размером и молекулярной массой. Фракция больших везикул имела размер более 150 нм и содержала высокомолекулярные и низкомолекулярные нуклеиновые кислоты. При этом, для везикул фракции Р100 определен размер от 30 до 200 нм, которые содержат только низкомолекулярные нуклеиновые кислоты. Разработан специфический зонд для идентификации микроРНК miR165а с помощью полимеразной цепной реакции. Применение зонда типа «стебель-петля» позволило получить матрицы кДНК размером более 70 пар нуклеотидов (п.н.), что является достаточным для оценки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Результаты ОТ-ПЦР-анализа со специфическими праймерами к микроРНК miR165a свидетельствуют о наличии продукта амплификации размером около 70-80 пар нуклеотидов, что соответствует теоретическим значениям. Следовательно, фракции внеклеточных везикул из листьев кукурузы содержат микроРНК miR165a, что, вероятно, обуславливает их физиологическую функцию межклеточного транспорта малых некодирующих РНК.
Скачивания
Литература
Xu Z., Xu Y., Zhang K., Liu Y., Liang Q., Thakur A., Liu W., Yan Y. Plant-derived extracellular vesicles (PDEVs) in nanomedicine for human disease and ther-apeutic modalities. J Nanobiotechnology. 2023; 21: 114. https://doi.org/10.1186/s12951-023-01858-7
Zhou Q., Ma K., Hu H., Xing X., Huang X., Gao H. Extracellular vesicles: Their functions in plant-pathogen interac-tions. Mol Plant Pathol. 2022; 23: 760-771. https://doi.org/10.1111/mpp.13170
Kocholata M., Maly J., Martinec J., Auer Malinska H. Plant Extracellular Vesi-cles and Their Potential in Human Health Research, the Practical Approach. Physiol Res. 2022; 71: 327-339. https://doi.org/10.33549/physiolres.934886
Alfieri M., Leone A., Ambrosone A. Plant-Derived Nano and Microvesicles for Human Health and Therapeutic Potential in Nanomedicine. Pharmaceutics. 2021; 13: 498. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13040498
Turchinovich A., Samatov T.R., Tonevitsky A.G., Burwinkel B. Circulating miRNAs: cell–cell communication func-tion? Front. Genet. 2013; 4: 119. https://doi.org/10.3389/fgene.2013.00119
Marin-Gonzalez E, Suarez-Lopez P. "And yet it moves": cell-to-cell and long-distance signaling by plant microRNAs. Plant Sci. 2012; 196: 18-30. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2012.07.009
Xu D., Di K., Fan B., Wu J., Gu X., Sun Y., Khan A., Li P., Li Z. MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front. Bioeng. Biotech-nol. 2022; 10: 948959. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.948959
Huang Y., Wang S., Cai Q., Jin H. Ef-fective methods for isolation and purifica-tion of extracellular vesicles from plants. J Integr Plant Biol. 2021; 63: 2020-2030. https://doi.org/10.1111/jipb.13181
Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guani-dinium thiocyanate-phenol-chloroform ex-traction. Analytical Biochemistry. 1987; 162: 156-159. https://doi.org/10.1006/abio.1987.9999
Fedorin D.N., Chuykova V.O., Ye-printsev A.T. Sozdaniye spetsificheskogo zonda «stebel'-petlya» dlya identifikatsii mikroRNK miR165a v list'yakh kukuruzy. Vestnik VGU. Seriya: Khimiya. Biologiya. Farmatsiya. 2023; 4: 41-47. (In Russ.)
Lakin G.F. Biometrics. M.: Higher school, 1990. 351 p. (In Russ.)
Cai Q., Halilovic L., Shi T., Chen A., He B., Wu H., Jin H. Extracellular ves-icles: cross-organismal RNA trafficking in plants, microbes, and mammalian cells. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 2023; 4: 262-282. https://doi.org/10.20517/evcna.2023.10
Cai Q., Qiao L., Wang M, He B., Lin F-M., Palmquist J., Huang S-D., Jin H. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence viru-lence genes. Science. 2018; 360: 1126-1129. https://doi.org/10.1126/science.aar4142
Karimi H.Z., Baldrich P., Rutter B.D., Borniego L., Zajt K.K., Meyers B.C., Innes R.W. Arabidopsis apoplastic fluid contains sRNA- and circular RNA–protein complexes that are located outside extra-cellular vesicles. The Plant Cell. 2022; 34: 1863-1881. https://doi.org/10.1093/plcell/koac043
Rutter B.D., Innes R.W. Extracellu-lar Vesicles Isolated from the Leaf Apo-plast Carry Stress-Response Proteins. Plant Physiology. 2017; 173: 728-741. https://doi.org/10.1104/pp.16.01253
Yan Y., Ham B-K. The Mobile Small RNAs: Important Messengers for Long-Distance Communication in Plants. Front Plant Sci. 2022; 13: 928729. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.928729
