Идентификация электрофоретическим способом продуктов рестрикционного анализа по сайту GATC геномной ДНК пшеницы при солевом стрессе

Аннотация

Современные методы исследования нуклеиновых кислот показали наличие в составе ДНК модифицированных азотистых оснований, главным образом, в виде их метилирования. Несмотря на то, что за последние несколько десятилетий было проделано много работы по выяснению роли 5-метилцитозина, только в последнее время было признано, что N(6)-метиладенин (^6mA) - N6-метиладенин присутствует в количественных и биологически активных уровнях в ДНК эукариотических клеток. Установлено, что содержание ^6mА может варьировать более чем на порядок в пределах изогенной популяции организмов и уровни ^6mА у этих организмов могут быть особенно чувствительны к незначительным изменениям в окружающей среде, например, к стрессовым факторам. Метилспецифичная рестрикция эндонуклеазой Mal 1 позволила выявить изменение аденилатного метильного статуса ДНК клеток листьев пшеницы в условиях солевого стресса. Это рестрицирующий фермент, распознающий метилированный аденин в составе последовательности нуклеотидов GATC и осуществляющий симметричную рестрикцию по данному сайту. Применение гуанидин-изотиоцианатной экстракции позволило выделить общую ДНК из клеток листьев пшеницы практически без следов деградации, что является необходимым условием для дальнейших аналитических исследований. Использование электрофоретического метода, обеспечивающего разделение фрагментов рестрикции на основе их заряда и размера, позволило оценить метильное состояние исследуемой последовательности ДНК листьев пшеницы в разных экспериментальных условиях. Анализ результатов рестрикционного анализа образцов ДНК пшеницы в разные часы засоления указывает, что в исследуемых образцах значительно меняется характер распределения продуктов рестрикции на основе их размера, что свидетельствует об изменении метильного статуса аденина в составе сайта GATC. Результаты денситометрии свидетельствуют об увеличении продуктов рестрикции по анализируемым сайтам. Относительно контрольного варианта, где обнаружены, в основном, высокомолекулярные рестрикционные фрагменты, на 24 час инкубации растений в растворе хлорида натрия основная доля продуктов рестрикции эндонуклеазой Mal 1 приходилась на низкомолекулярные. Увеличение продуктов рестрикции геномной ДНК пшеницы на 24 час эксперимента свидетельствует о большем количестве метилированного аденина в составе сайта GATC в данный период эксперимента. Изменение характера распределения метилирования аденина может являться регуляторным механизмом контроля адаптивной реакции клеточного метаболизма листьев пшеницы на уровне экспрессионной активности соответствующих генов.